高彩霞研究员做客水木清华生命科学讲座讲述“新一代CRISPR技术：基于基因编辑的作物改良”
2022年9月8日下午，中科院遗传发育所分子农业生物学研究中心研究员高彩霞做客水木清华生命科学讲座，为师生们做了题为“Next-generation CRISPR Technologies and Their Application in Crop Improvement ”的学术报告。报告在清华大学生物医学馆E109举行，由生命中心刘俊杰主持。
高彩霞老师的报告围绕作物的基因组编辑，介绍了以CRISPR基因编辑技术为主的各项育种技术，展示了多项利用CRISPR系统改造作物性状的研究历程和研究成果。
高老师首先介绍了基因编辑的历史。作物的育种是一项传统久远的技术，只到上世纪DNA作为遗传信息的载体被发现后，基因编辑技术逐渐发展起来，极大推动了作物育种的进程。早期的编辑手段，ZFN和TELEN技术，采用蛋白模块靶向特定位点，因而每个编辑位点都需要独特的工程化的蛋白。2012年发展起来的CRISPR技术，利用引导RNA和DNA位点的互补配对实现靶向，利用Cas蛋白实现双链的切割。由于RNA靶向序列的极容易编程并可以同时实现多位点的编辑， CRISPR系统迅速成为基因编辑的热门工具。在作物优良性状的改良中，CRISPR基因编辑技术也展现了显著的优势和效果。早期的CRISPR技术编辑做基因编辑主要是靠切开DNA双链后发生的脱氧核苷酸随机的插入或者缺失实现基因的knock out，故而编辑后的产物序列不是纯合体，且无法准确预测。在2016年和2019年，David Liu研究团队相继开发了全新的基因组编辑工具base editor和prime editor，实现了基因组的精准编辑。
基因组的精准编辑对于人类遗传疾病的治疗具有重要意义，据统计，58%的遗传疾病来自于单碱基的突变。在作物育种领域，植物的单核苷酸多态性和众多性状紧密相关联。碱基编辑器主要包括胞嘧啶碱基编辑器CBE和腺嘌呤碱基编辑器ABE，二者可以在不引起双链断裂的情况下实现C·G到T·A或A·T到G·C的转换。然而初期的base editor靶向的窗口比较小，更适合进行点突变；在应用于作物改良时，不能有效地编辑大豆和马铃薯等作物。基于此，高老师团队度对多种脱氨酶的同源蛋白进行筛选，最后筛到人源的APOBEC3A蛋白。通过对比，人源的APOBEC3A大幅度地提高了精准编辑的效率，尤其在马铃薯里实现了10倍的提高。同时，新的工具也解除了“CG”序列相邻对CBE的限制，脱氨的窗口也从5~7拓展到了1~17，给基因的精准编辑提供了更多选择，拓展了应用范围。进一步，高老师团队将ABE和CBE组成了STEME系统，对除草剂靶向的保守基因的400aa的domain进行饱和突变，收获的样品喷洒除草剂观察性状。通过对具有抗性的样品的测序，团队筛到了P1927F这个崭新的突变位点以及已经报道过的W2125C位点，展示出STEME技术对大规模突变体筛选的优势。
进一步，高彩霞老师从碱基编辑器的nickase活性得到启发，设计在一条链上引入两个nickase的位点，从而实现中间片段的deletion。团队将野生型SpCas9与胞嘧啶脱氨酶APOBEC、尿嘧啶糖基化酶(UDG)以及无嘌呤嘧啶位点裂合酶（AP lyase）组合，建立了新型的多核苷酸靶向删除系统（APOBEC-Cas9 fusion-induced deletion systems, AFIDs），并成功在水稻和小麦基因组中实现了精准、可预测的多核苷酸删除，，可预测的删除比例高达30%以上。团队利用此项技术删除了水稻易感基因OsSWEET14的启动子的效应子结合元件。通过白叶枯菌的接种实验发现：该系统产生的多核苷酸删除水稻突变体对白叶枯病菌的抗性比只用野生型Cas9来knock out的效果更强。
除了碱基编辑器，高老师团队也对prime editor进行了进一步改造。最初版本的编辑器编辑效率低，效果差异大，容易受到PBS和/或RT模板长度以及nicking sgRNA位置的影响。针对这些，团队大规模检测了不同PBS长度和位置对效率的影响，总结出最适的PBS对应的Tm值，同时发现引入双pegRNA和使用其他特定逆转录酶也能大幅度提升编辑效率。高老师也介绍了其他研究人员的优化，包括：在pegRNA前端引入稳定的茎环结构稳定RNA; 采用M-MLV逆转录酶等。
除了底层编辑技术的开发和优化，高老师团队也建立了许多基于CRISPR技术的作物育种 、育苗的体系。针对异源六倍体的小麦，团队通过金颗粒递送和genotyping，利用RNP系统对小麦的多个位点进行了改造，规避了传统育种方式回交时间长，外源基因整合的问题。在小麦抗白粉病的研究中，团队尝试解决小麦的感病基因MLO突变体早衰、低产的问题。他们在大量的基因组编辑小麦突变体中筛选获得了一个新型MLO突变体Tamlo-R32，该突变体表现出对白粉菌完全的抗性，同时生长发育和产量正常。后期的工作发现TaMLO-B1 位点附近存在约304Kb的大片段删除导致的上游基因TaTMT3的表达水平上升，进而克服了感病基因MLO突变引起的减产。
最后，高老师介绍了利用基因编辑技术的新的育种策略，包括靶向特定基因，改善番茄育种进程，增大番茄果实的成果；改造基因上游转录起始位点（uORF），在T0代获得果实糖含量不同的纯合突变体等。
高彩霞老师精彩的报告内容引发了同学们的积极讨论，同学们在报告结束后踊跃提问发言。高老师也对同学们提问给出了细致的回答。
