科研进展
《Cell》杂志报道郭红卫研究组在植物激素领域突破性进展
2015年10月22日国际知名学术期刊Cell发表了生命科学联合中心郭红卫研究组的最新研究成果---拟南芥中EIN2蛋白在翻译水平调控乙烯信号转导（EIN2-Directed Translational Regulation of Ethylene Signaling in Arabidopsis）。该项工作系统、深入地研究了植物激素乙烯信号转导通路中核心正调因子EIN2在细胞质的功能，发现EIN2可以和EBF1 mRNA、EBF2 mRNA的3’UTR相互作用并抑制EBF1/2的翻译过程进而激活乙烯反应。
乙烯是一种无色、无味的气体，虽然其化学结构简单但是作为植物激素却调控从种子萌发到花与叶片的衰老、果实成熟，以及细胞的程序性死亡等几乎所有的植物生长发育过程。同时，乙烯在应对病虫害等生物胁迫和低温胁迫、盐胁迫等非生物胁迫方面也扮演着至关重要的角色。采摘后的果实会因产生大量的乙烯导致过熟从而大大缩短仓储期和货架期；不利天气因素和严重的病虫害会诱导农作物产生大量的乙烯进而导致早衰减产，这些都给农业生产带来很大的损失。所以，对植物激素乙烯的深入研究具有重要的理论意义和应用价值。
经过二十多年的研究，科学家们在模式植物拟南芥中建立了一条自内质网膜上的受体至细胞核内的转录因子的线性乙烯信号转导通路。其中，EIN2（ETHYLENE INSENSITIVE 2）是植物响应乙烯的核心正调因子，其功能缺失功能会导致植物完全丧失乙烯反应。此外，EIN3（ETHYLENE INSENSITIVE 3）和EIL1（EIN3-Like protein 1）是两个位于细胞核内的转录因子，它们调控了几乎全部乙烯响应基因的表达；且它们受F-box蛋白EBF1（EIN3-Binding F-Box Protein 1）和EBF2所介导的26S/泛素蛋白酶体途径而降解。乙烯信号通路的一个关键机制是通过某种依赖EIN2的方式维持EIN3/EIL1的蛋白稳定性。自EIN2基因于1999年被克隆以来，人们一直想知道定位于内质网膜（ER）的EIN2蛋白是如何调控乙烯信号转导的。
EIN2的核心作用及其蛋白结构与亚细胞定位。（A）ein2突变体表型；（B）EIN2蛋白的二级结构；（C）3D渲染图示当细胞内存在乙烯时EIN2蛋白的亚细胞定位，包括细胞核（蓝色）、ER（紫色）、细胞质（绿色）等。
EIN2蛋白共有1294个氨基酸的跨膜蛋白，N端含有12个跨膜结构域将EIN2锚定在ER上；C端为亲水区，虽然在植物中非常保守，但是并不含有与已知的结构域相似的结构域。前人的研究表明，EIN2的N端作为一个跨膜结构接受上游的信号，而C端参与了乙烯的信号转导并将信号向下转导。2012年，包括北京大学生命科学学院郭红卫领导的课题组在内的三个研究小组同时报道了EIN2激活下游乙烯信号的“剪切、穿梭”模型，即当细胞内乙烯浓度较高时， EIN2被激活且其C端（CEND）被蛋白酶剪切而脱离ER进入细胞核并以某种方式激活EIN3/EIL1和乙烯反应。郭红卫团队还发现乙烯不但能诱导CEND进入细胞核，而且还促进其在细胞质中形成明亮的、随机分布的点状结构，这暗示EIN2在细胞质中可能具有重要的功能。此外，当人们通过诱导的方式强制CEND全部进入细胞核发现只能部分激活乙烯反应，这表明CEND在细胞核之外还可能有重要的功能。
2006年郭红卫研究组和国外一个研究组曾同时报道一个叫做EIN5的5’→3’核酸外切酶具有负调EBF1/2功能的作用。非常有意思的是，他们还发现在ein5的突变体中与EBF1/2 mRNA 3’UTR对应的小片段大量积累。郭红卫团队大胆假设ein5突变体的乙烯不敏感表型是由其体内大量积累3’UTR片段所导致。为了验证这个假设，他们分别将与EBF1/2的3’UTR对应的片段过表达在野生型拟南芥（WT）中，令人惊讶的是转基因植株表现出了明显的乙烯不敏感表型。进一步的遗传和生化实验表明，外源过表达的3’UTR在翻译水平增强内源EBF1/2的表达。藉此，郭红卫团队首次观察到EBF1/2 mRNA的3’UTR可能具有负调EBF1/2翻译的功能。
在此基础上研究人员以EBF1 3’UTR为例构建了报告基因GFP-3’UTR，并发现乙烯以依赖EIN2的方式作用在3’UTR上抑制mRNA的翻译过程。EBF1 mRNA的3’UTR和EBF2 mRNA的3’UTR长度分别为643nt和590nt，在这么长的序列中，是哪些顺式作用元件介导了翻译抑制过程呢？该研究组在烟草中构建了双荧光3’UTR功能分析系统，发现一系列位于mRNA茎环结构的环上的连续的尿嘧啶PolyU，且在EBF1和EBF2 mRNA的3’UTR中分别有7个和5个介导翻译抑制的PolyU。遗传分析表明删除EBF1 mRNA中的3’UTR 或者PolyU均会导致拟南芥具有几乎完全乙烯不敏感表型，这说明3’UTR和PolyU为EBF1/2 mRNA 3’UTR中响应EIN2并介导乙烯信号正常传递所必需。
乙烯通过EIN2作用在3’UTR上负调翻译以及顺式作用元件PolyU。（A）报告RNA GFP-3’UTR的结构；（B）不同突变体内GFP荧光变化；（C-D）PolyU及其二级结构；（E）在ebf1突变体中表达内源EBF1启动子驱动的野生型EBF1（EBF1/ebf1）以及删除3’UTR（EBF1△3’UTR/ebf1）和7个PolyU（EBF1△PolyU/ebf1）的EBF1。
研究人员接着探索了EIN2通过EBF1/2 mRNA 3’UTR调控翻译过程的生化机制。他们首先观察了含有EBF1 3’UTR的报告RNA的亚细胞定位，并发现乙烯诱导该RNA在细胞质内形成点状结构。有意思的是外源乙烯处理可以促进EIN2和含有EBF1 3’UTR的报告RNA共定位在点状结构中。RNA-IP（RNA immunoprecipitation）实验表明乙烯可以促进EIN2和EBF1 3’UTR在植物体内发生相互作用。在真核生物中，P-body（processing body）是mRNA转录后调控的重要场所，参与mRNA降解、翻译抑制等重要过程。上文提到的EIN5，又称作AtXRN4，是酵母中5’à3’外切核酸酶XRN1（5'-3' EXORIBONUCLEASE 1）的同源蛋白，是已知的参与形成P-body的标志蛋白。郭红卫研究组发现，乙烯能够促进EIN2以及包含EBF1 3’UTR的报告RNA与EIN5共定位于细胞质内中的P-body。进一步的生化分析表明EIN2能够与包括EIN5、UPF1（UPSTREAM OPEN-READING FRAME 1）、PAB2（POLY(A) BINDING 2）、PAB4、 PAB8等在内的多种P-body组分在体内发生相互作用。
EBF1 3’UTR与EIN2以及EIN5等因子共定位于P-body。图中白色箭头代表细胞质中的点状结构，黄色为红、绿颜色叠加。
郭红卫团队的研究表明，细胞质中的EIN2识别并结合EBF1/2 mRNA的3’UTR，并通过招募EIN5等相关调节因子形成点状结构P-body，进而抑制EBF1/2 mRNA的翻译，导致EBF1/2蛋白含量急剧减少，进而使得EIN3/EIL1在细胞核内大量积累，从而激活下游乙烯反应。郭红卫团队的成果阐明了EIN2蛋白在细胞质中的新功能、发现了一类新的响应乙烯信号的RNA元件PolyU序列，并揭示了一条新的乙烯信号转导通路。同时，他们的研究成果在植物信号转导领域第一次表明mRNA的3’UTR像一个“感受器”感知上游信号并向下传递，对植物学的研究具有重要的启发意义。此外，该研究成果还具有重要的应用前景，可以利用EIN2 CEND对EBF1/2 mRNA的3’UTR调控作用人为控制乙烯信号“打开”或者“关闭”乙烯信号来抵御各种胁迫或者延迟果实的成熟和农作物的衰老，为农业生产实践服务。
EIN2所介导的乙烯信号转导通路。（a）“剪切、穿梭”模型；（b）翻译抑制模型。
北京大学生科院李文阳博士（生命中心博后）、博士生马梦迪是这篇论文的并列第一作者，博士生冯莹和李红姜博士、王益川博士（生命中心博后）、本科生马雨桐在研究过程中发挥了关键性作用，李明喆博士、安丰英博士在研究过程中亦有重要贡献，生命科学学院教授、北大-清华生命科学联合中心郭红卫是该论文的通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金、科技部973计划和生命科学联合中心的资助。
