生命中心杨茂君研究组
于线粒体呼吸链研究领域再次取得突破性研究成果
2017年8月24日，生命中心杨茂君研究组在国际顶级期刊《细胞》（Cell）杂志在线发表《人源线粒体呼吸链超超级复合物I2III2IV2的结构》（Architecture of Human Mitochondrial Respiratory Megacomplex I2III2IV2）,突破性地解析了目前所知的人源呼吸链蛋白质最高级的组织形式——超超级复合物（MCI2III2IV2）中高分辨率三维结构,以及超级复合物（SCI1III2IV1）的原子分辨率结构（图1）。这是继2016年9月和12月，杨茂君研究组分别在《自然》（Nature）杂志和《细胞》杂志发表研究长文，详细阐释了猪源呼吸链超级复合物I1III2IV1（呼吸体）的原子分辨率三维结构之后的又一项重大突破。在此次发表的文章中，杨茂君研究组首次获得了来源于人类细胞的呼吸链蛋白复合物样品，并且运用冷冻电镜三维重构的方法首次成功解析了比呼吸体更高聚集形式的呼吸链超超级复合物的三维结构，证明了线粒体呼吸链复合物存在更高级的组成形式，为此前一直处于各种猜想阶段的最高级线粒体呼吸链复合物组织形式的存在提供了直接的证据，是该研究领域的一项重大研究突破。
呼吸作用是生物体内最基础的能量代谢活动之一，是由位于线粒体内膜上的四种呼吸链蛋白复合物分步完成的，这四种蛋白复合物分别为复合物I（NADH脱氢酶）、复合物II（琥珀酸脱氢酶）、复合物III（细胞色素c还原酶）和复合物IV（细胞色素c氧化酶）。以这些复合物为基础，可以聚合形成多层次的呼吸链超级复合物乃至超超级复合物，获得更高的稳定性和更高的能量转换效率。一百多年来，对线粒体呼吸链的研究一直都是国际生命科学领域的热点之一。彼得•米切尔（Peter D. Mitchell）曾于1978年因提出线粒体呼吸链的化学渗透假说而获得了诺贝尔化学奖；1997年英国著名结构生物学家约翰•沃克（John E. Walker）因对线粒体复合物V（ATP合成酶）的结构生物学研究而获得诺贝尔化学奖。
杨茂君研究组长期致力于线粒体呼吸链蛋白的结构与功能研究，此前曾于2012年在《自然》杂志报道了II-型线粒体呼吸链复合物I（NDH2）的结构，揭示了其调控及电子传递机制，为设计针对NDH2为靶点的药物奠定了良好的基础。2017年杨茂君研究组又分别在《PCCP》、《JMC》等杂志连续报道了NDH2的详细电子传递机制，同时开发了以疟原虫NDH2为靶标的针对耐药性疟原虫的新型抗疟疾药物前体分子，为开发新的治疗疟疾的药物打下了良好的基础。经过多年的努力，杨茂君研究组于2016年终于攻克了哺乳动物线粒体呼吸链超级复合物的原子分辨率结构这一国际性难题。该复合物是由一个复合物I，两个复合物III和一个复合物IV构成。是包括44个膜蛋白在内的81个蛋白亚基（69种不同蛋白分子）所构成的超大分子机器。该系列研究揭示了复合物I各亚基之间细致的相互作用，鉴定出了各复合物蛋白亚基之间及复合物之间的结合方式，发现了磷脂分子在呼吸体结构中发挥的重要作用。值得一提的是，杨茂君依据结构信息提出了全新的线粒体呼吸链之间电子传递与质子转运的模型。该模型与目前占统治地位的、1975年由诺贝尔奖获得者彼得•米切尔提出的Q-循环（Q-Cycle）假说完全不同。
在此次发表的论文中，杨茂君研究组在世界范围内首次从体外培养的人源细胞中分离、纯化出高纯度的呼吸链蛋白复合物，解析了呼吸链超级和超超级复合物的三维结构，从而第一次直接证明了高于呼吸体的呼吸链超超级蛋白复合物的组织形式的存在。该研究是一百多年以来人类针对线粒体呼吸链蛋白研究中在世界范围内首次获得的人源蛋白质复合物结构。 在该论文中，杨茂君研究组首次阐述了人源线粒体复合物I （3.4-3.7Å）， 复合物III（3.4 Å），复合物IV（5.2 Å），超级复合物I1III2IV1（3.9 Å）和超超级复合物I2III2IV2（17.2 Å）的结构（图1）。 此外，文章中重点报道了呼吸链超超级复合物近乎中心对称的环形结构。有趣的是，在二聚的复合物III线粒体膜间隙一侧观测到了两个处于结合状态的细胞色素c蛋白亚基，该结构细节有力地证明了环形结构中心的两个复合物III的单体都是有活性的，否定了之前其他研究组提出的复合物III半失活理论。此结果进一步支持了杨茂君之前提出的全新的电子传递模型，而非长久以来占领学界的Q循环（Q-Cycle）模型。此外，通过计算机模拟的方法，杨茂君研究组还首次将复合物II的结构嵌入进呼吸链超级复合物的模型之中，由此可以推论在线粒体呼吸链中四个电子传递链蛋白将组合成一个更大的超超级复合物来更高效的发挥功能，从而将全部四个呼吸链复合物在结构水平统一到了一起，巧妙的预测了呼吸链复合物全新的完整聚合形式，为之后的研究提供了一条新的思路。人类线粒体呼吸链系统异常会导致如阿兹海默综合症、帕金森综合症、多发性硬化、少年脊髓型共济失调以及肌萎缩性脊髓侧索硬化症等多种疾病。由于人源线粒体呼吸链蛋白复合物的纯化条件极为苛刻、难度系数大，所以针对这些蛋白的药物筛选一直都很难开展。杨茂君研究组建立的一系列蛋白纯化方法和技术为今后的药物研发打下了良好的基础，其结构的解析不仅阐明了这些蛋白的作用方式及反应机理，也为人类攻克线粒体呼吸链系统异常所导致的疾病提供了一个良好的开端。
在文章的审稿过程中，审稿人指出“The circular structure with a total of 140 subunits is impressive and provides unprecedented insight into the mitochondrial respirasome. ”。（这一由140个亚基构成的环形结构令人印象深刻，为线粒体呼吸链复合物的组成形式提供了史无前例的视点）“This manuscript represents a major step forward in understanding the structural and functional organization of the mitochondrial respiratory chain.”。（这篇文章是理解线粒体呼吸链的结构和功能构成的重要一步）。杨茂君研究组今后将对线粒体呼吸链继续进行更加深入的研究，希望获得处于不同反应中间态的呼吸链复合物群的分辨率更高的三维结构，并将致力于研发治疗线粒体异常疾病的新型靶向药物。“生死只在呼吸之间”，杨茂君曾多次在公开演讲中提到：“呼吸是最基本的生命活动，最为平常但却十分神秘。针对呼吸作用的研究我们已经走在世界前列，但是许多重要的细节仍在等待未来科学家们通过共同的努力来加以解析。希望我们的研究能为人类对生命现象的认知作出更大的贡献。”
清华大学生命科学学院博士生郭润域（15级）、宗帅（13级）、吴萌（14级），结构生物学高精尖创新中心卓越学者谷金科（17级博士后）是此篇论文的共同第一作者，此外，郭润域、吴萌和谷金科还是另外两篇《自然》和《细胞》论文的共同第一作者，杨茂君为此系列论文的通讯作者。电镜数据采集于清华大学冷冻电镜平台，计算工作得到清华大学高性能计算平台的支持。本工作获得生命科学联合中心、清华大学结构生物学高精尖创新中心、国家蛋白质科学研究（北京）设施清华基地、清华大学自主科研基金、清华大学蛋白质科学教育部重点实验室、科技部重大科学研究计划专项、国家杰出青年基金、国家自然科学基金的大力支持。
图1 人源呼吸链超超级复合物整体结构
左图上，人源线粒体呼吸链超超级复合物I2III2IV2结构模型；左图下，线粒体膜间隙一侧，复合物III和IV中细胞色素c结合位点。右图上，线粒体呼吸链复合物完整聚合形式预测模型I2II2III2IV2；右图下，线粒体膜间隙一侧，细胞色素c参与电子传递时在复合物III和IV之间的运动路径。Megacomplex，超超级复合物；M线粒体基质；IM，线粒体内膜；IM，线粒体膜间隙；CI，复合物I；CII，复合物II；CIII，复合物III；CIV，复合物IV；Cyt.c，细胞色素c。
原文链接：http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)30887-5
论文全文：http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867417308875
相关论文：
人源及哺乳动物线粒体呼吸链复合物方向：
1 Guo, R., Zong, S., Wu, M., Gu, J. & Yang, M. Architecture of Human Mitochondrial Respiratory Megacomplex I2III2IV2. Cell (2017).
2 Gu, J. et al. The architecture of the mammalian respirasome. Nature 537, 639-643, doi:10.1038/nature19359 (2016).
3 Wu, M., Gu, J., Guo, R., Huang, Y. & Yang, M. Structure of Mammalian Respiratory Supercomplex I1III2IV1. Cell 167, 1598-1609 e1510, doi:10.1016/j.cell.2016.11.012 (2016).
4 Guo, R., Gu, J., Wu, M. & Yang, M. Amazing structure of respirasome: unveiling the secrets of cell respiration. Protein Cell 7, 854-865, doi:10.1007/s13238-016-0329-7 (2016).
II-型NADH脱氢酶（NDH2）方向：
1 Feng, Y. et al. Structural insight into the type-II mitochondrial NADH dehydrogenases. Nature 491, 478-482, doi:10.1038/nature11541 (2012).
2 Wu, K. et al. Temperature-dependent ESR and computational studies on antiferromagnetic electron transfer in the yeast NADH dehydrogenase Ndi1. Phys Chem Chem Phys 19, 4849-4854, doi:10.1039/c6cp08107j (2017).
3 Yang, Y. et al. Target Elucidation by Cocrystal Structures of NADH-Ubiquinone Oxidoreductase of Plasmodium falciparum (PfNDH2) with Small Molecule To Eliminate Drug-Resistant Malaria. J Med Chem 60, 1994-2005, doi:10.1021/acs.jmedchem.6b01733 (2017).
