基因的表达是生物体一切生命活动的基础，DNA甲基化、组蛋白修饰、核小体重新定位等表观遗传的调节对基因表达调控具有重要作用。这些表观遗传修饰的变化往往会导致基因表达的改变，从而进一步对基因组稳态的维持，发育的时空调节，细胞的命运决定等重要的生命过程产生影响。蛋白质和DNA相互作用的染色质免疫共沉淀技术 (ChIP-seq) 技术是研究表观遗传调控的一种重要手段，这项技术可在全基因组范围内识别顺式调控元件和反式作用因子的互作信息，并能构建基因表达调控网络，从而加深我们对生命过程调控机制的理解。

 

单细胞测序技术目前被广泛用于研究发育与疾病相关细胞群体异质性和绘制细胞图谱。随着技术的发展，这项技术正逐渐将生命科学研究推进到新的维度。在单细胞表观组领域，虽然DNA甲基化测序、染色质构象捕获技术、染色质开放程度测序已经分别在2013年 (scRRBS [1])、2013年 (single cell Hi-C [2])、2015年 (scATAC-seq [3])实现了单细胞水平测序。研究基因表达调控与细胞命运决定的机制，最直接的证据是特定染色质区域与蛋白的相互作用，然而，高效的单细胞染色质免疫共沉淀测序（scChIP-seq）技术尚未出现。

 

常规ChIP-seq技术需要使用超声打断交联的基因组片段，然后用特异性抗体富集含有目的蛋白结合的基因组片段，并将目的DNA片段纯化后，添加接头进行建库测序。这一系列操作使得ChIP-seq需要百万个细胞作为起始材料。为降低ChIP-seq技术对细胞数目的要求，近年来，MOWChIP [4]，STAR-ChIP [5] 和ULI-NChIP [6] 等适用于少量细胞起始的ChIP-seq技术被逐渐开发出来，但细胞群体的异质性，发育过程中染色质状态的动态变化需要在单细胞分辨率进行进一步的研究。虽然Drop-ChIP [7] 第一次实现了单细胞水平ChIP-seq，然而这一技术依赖特殊的微流控装置，并且每个细胞只能捕获到约800个DNA片段，这极大地限制了这项技术的推广应用。随后开发的scChIC-seq [8] 虽然实现了单细胞水平的解析，但是获得的单细胞数据的基因组比对率只有约6.1 %，大大增加了测序成本，且通量较低。另外，单细胞CUT&Tag [9] 需要依赖Takara ICELL8这一特殊装置。综上，目前还缺乏一种具有普适性，易操作，高质量的单细胞ChIP-seq技术。为此，何爱彬课题组开发出一种新型单细胞ChIP技术CoBATCH，巧妙地将染色质片段化和PCR接头添加融合在一步完成，显著地提高了ChIP的效率，同时用组合标签的方法实现了对单细胞进行高通量地标记，是目前世界上最先进，最高效的ChIP-seq技术，并用这项技术首次解析了多器官内皮细胞谱系发育的表观与功能异质性。这项研究将单细胞表观组学新技术的研究、普及和应用往前推进了一大步。

 

研究人员首先开发了一种新的适用于少量起始细胞的技术，并命名为in situ ChIP（即不需要消化分离细胞组织）。在这一技术中，作者将Protein A蛋白与转座酶Tn5的N端进行融合得到融合蛋白Protein A-Tn5 (PAT)。将目的细胞与特定抗体孵育之后，向细胞中加入PAT融合蛋白并与特定的抗体结合。之后，激活PAT的反应活性，被抗体识别的特定基因组区域能被PAT切割，并带上接头序列。终止反应后，带上接头的目的DNA片段能直接用于PCR和建库（图1）。

 

 

图1 原位细胞与组织 in situ ChIP技术原理图

 

重要的是，in situ ChIP技术可直接用于不经过消化的胚胎样品和组织切片。研究人员对小鼠E6.5, E7.0和E7.5未经消化的整个胚胎进行H3K27ac和H3K4me3 in situ ChIP-seq，发现这些组蛋白修饰在胚胎发育相关的特定基因组区域有明显的富集，GO分析表明，这些特异富集的信号与胚层发育过程密切相关。另外，研究人员证明in situ ChIP同样适用于捕获少量细胞转录因子在基因组的结合信息。因此，in situ ChIP对样品本身没有限制，原管操作简单方便，实验能在一天内完成，大大提高了ChIP的效率，有极强的应用价值和普适性。

 

进一步地，研究者对in situ ChIP进行拓展，创造性地将PAT处理基因组DNA与组合标签标记单细胞两种方法结合起来，首次开发出具有高通量特性和普适性的单细胞ChIP-seq方法，命名为CoBATCH（图2）。其原理是将孵育完抗体的细胞分到不同的孔，用带有不同barcode的PAT进行切割后使细胞带上第一轮标签，然后将所有细胞合并，重新分配到不同的孔，最后用不同的PCR引物进行扩增使细胞带上第二轮标签。利用这一方法，研究人员能在每一个单细胞中捕获平均12,000个非重复DNA片段，且一次实验通量可达10,000单细胞。与其他单细胞ChIP-seq技术相比，CoBATCH具有更高的准确性，信噪比，基因组比对率，并能捕获更多的单细胞DNA片段。

 

图2 高通量单细胞ChIP-seq CoBATCH 技术流程图

 

内皮细胞组成了哺乳动物体内的脉管系统，和血液循环、造血、免疫、压力感应以及器官形态建成等生命活动密切相关。研究者应用CoBATCH技术解析了小鼠胚胎期16.5天，来自10个器官的Cdh5+ 谱系的内皮细胞的H3K27ac水平的异质性，通过系统的生物信息学分析，作者精确地识别了不同的细胞亚群，它们分别与动静脉的发育，内皮-间质转化（EndoMT）等过程相关，并且，不同器官来源的细胞可能保留着胚层发育的表观信息。有趣的是，作者还鉴定了一群与免疫相关的细胞，它们可能参与了免疫系统的发育和调控。同时，心脏内皮谱系的细胞也表现出很强的内部的异质性，作者用RNA Pol II和H3K36me3 CoBATCH单细胞数据识别出巨噬细胞样细胞，间质细胞和内皮细胞等不同的细胞类型。这些研究结果证明了CoBATCH可以解析不同器官来源的内皮细胞表观异质性以及顺式作用元件在发育过程中的动态变化，为理解器官功能特异的内皮细胞发育提供了重要线索。

 

简而言之，CoBATCH技术是第一个具有普适性、高质量、高通量的单细胞ChIP-seq方法，该技术将在单细胞水平上为解析细胞命运决定和功能异质性的表观遗传调控机制提供强有力的支持，并对研究器官发育和疾病发生过程具有重大的意义。北京大学分子医学研究所博士生王千昊、艾珊珊、刘雅茜和北京大学-清华大学生命科学联合中心博士生熊海清、余先红为论文共同第一作者，何爱彬研究员为本文的通讯作者。该研究获得了科技部干细胞专项、国家自然科学基金委的和生命科学联合中心的支持。

 

[1] Guo, H., et al., Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing. Genome Res, 2013. 23(12): p. 2126-35.

[2] Nagano, T., et al., Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature, 2013. 502(7469): p. 59-64.

[3] Buenrostro, J.D., et al., Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature, 2015. 523(7561): p. 486-90.

[4] Cao, Z., et al., A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells. Nat Methods, 2015. 12(10): p. 959-62.

[5] Zhang, B., et al., Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature, 2016. 537(7621): p. 553-557.

[6] Brind'Amour, J., et al., An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun, 2015. 6: p. 6033.

[7] Rotem, A., et al., Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotechnol, 2015. 33(11): p. 1165-72.

[8] Ku, W.L., et al., Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nat Methods, 2019. 16(4): p. 323-325.

[9] Kaya-Okur, H.S., et al., CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun, 2019. 10(1): p. 1930.