雷晓光课题组与合作者一起发现植物利用独特的天然产物实现“不战而屈人之兵”的抗菌策略
2020年4月8日，北京大学雷晓光课题组与合作者中国科学院遗传与发育生物学研究所周俭民课题组、国家蛋白质中心杨靖课题组共同在Cell子刊《Cell Host＆Microbe》杂志上发表了题为“An Arabidopsis secondary metabolite directly targets expression of the bacterial type III secretion system to inhibit bacterial virulence”的文章，阐明了植物通过产生异硫氰酸酯类小分子天然产物Sulforaphane（SFN）特异性抑制植物病原菌III型分泌系统，从而达到“不战而屈人之兵”的有效抗菌策略。该研究发现了植物内源天然产物在植物与微生物相互作用中所扮演的重要角色，揭示了新颖的生物作用机制，为植物保护提供了新的研究思路。
植物产生的硫代葡萄糖苷类天然产物因为其独特的生物活性受到广泛关注。硫苷是植物体内合成的含氮、硫的次生代谢化合物，在十字花科植物中含量较高。硫苷通过芥子酶的作用可形成包括异硫氰酸酯（Isothiocyanate）在内的一系列下游天然产物，在植物抵御病原菌侵染以及昆虫的取食中发挥着重要的作用。除了在植物防卫中起到重要作用，异硫氰酸酯类化合物也被证实具有很好的抗肿瘤活性。前期大量的流行病学研究显示：食用富含异硫氰酸酯类化合物的十字花科植物如卷心菜、西兰花等，能有效地降低胃肠道癌症风险。因此，这类化合物一直被认为是西兰花等蔬菜产生癌症预防功效的主要活性成分。但是，这类植物内源性天然产物对于植物自身生理、病理过程的具体作用机制尚不清楚。
图片摘自：https://www.healthwriting.com/wp-content/uploads/sulforophane-featured.jpg
许多植物天然产物通过抑制细菌的生命活动杀死细菌，这一过程对有害和有益微生物都具有杀伤作用，因此容易导致细菌耐药性的产生。前期研究表明，植物有可能通过一些未知的机制，特异性抑制植物病原菌III型分泌系统相关基因的表达，使得植物病原菌无法通过III型分泌系统分泌致病效应蛋白，从而起到降低病原菌的致病性。因此，探究植物如何通过让病原菌的致病“武器”III型分泌系统失效，将病原菌与共生菌区别开来，达到“不战而屈人之兵”的抗菌效果，已经成为植物生物学研究领域一个很重要的科学问题。
雷晓光课题组一直致力于天然产物合成与化学生物学研究，主要聚焦在揭示植物来源天然产物独特的生物活性机制，开发有效的化学合成与生物合成策略，高效制备结构复杂的天然产物分子，以及开展天然产物创新药物研究。在本课题中，雷晓光课题组与周俭民课题组合作，利用生物活性导向的天然产物分离策略，首先观察到拟南芥的醇提物具有抑制丁香假单胞菌III型分泌系统相关基因（效应蛋白、转录调控因子）的转录以及表达的作用，通过多次化学分离、纯化过程得到了具有最强抑制活性的天然产物分子。通过核磁共振、质谱等化学结构表征手段，鉴定出该天然产物分子为Sulforaphane（SFN）。进一步生物验证表明：在SFN作用下，III型分泌系统分泌的效应蛋白α-AvrPto的表达水平显著下降，相关基因的转录水平也随着SFN浓度升高而降低。在拟南芥植株上对SFN生物合成途径进行敲除后，拟南芥胞间液中不再检出SFN，与之相对应的是敲除生物合成途径的突变株比野生型更易感病，从植株水平确证了SFN作为拟南芥防御分子的作用。
图片摘自：Wang et al., 2020, Cell Host & Microbe 27, 601–613
为了阐明SFN的明确生物作用机制，作者进一步通过转录组分析以及化学蛋白质组学鉴定出了SFN分子的相互作用靶点蛋白和具体作用位点。SFN具有亲电性的异硫氰基，能够通过加成反应共价的结合半胱氨酸（cys）上的硫醇。因此作者采取了化学蛋白质组学技术中的定量硫醇反应活性分析技术(Quantitative Thiol Reactivity Profiling, QTRP)，全局性以及位点特异性地寻找SFN结合的半胱氨酸残基。首先作者将Pst DC3000用SFN处理2h（对照组不加SFN）,接着分别提取全蛋白。接着利用具有硫醇反应性的生物正交反应探针，对半胱氨酸残基进行一个全局性的标记，之后酶切成肽段。之后用轻重同位素标记的可光解的叠氮生物素与SFN处理组和未处理组的肽段进行生物正交反应，并用链霉亲和素富集。最后光解后获得轻重同位素标记的肽段，通过LC-MS分析。在SFN处理组中标记的特定的含半胱氨酸肽段数量的减少，则说明SFN对特定的半胱氨酸残基的结合。通过这样的策略，作者鉴定出了在III型分泌系统调控转录因子HrpS的209位存在着SFN的修饰。进一步实验证明，SFN共价结合了HrpS的209位半胱氨酸，阻止了HrpS和HrpR的结合。而HrpS和HrpR只有结合形成异源六聚体，才能激活hrpL基因的表达。HrpL作为选择性σ因子，诱导丁香假单胞菌III型分泌系统相关基因的表达。进一步研究还发现该类天然产物只对植物治病菌有抑制作用，而对于很多植物共生菌没有明显抑制作用。
图片摘自：Wang et al., 2020, Cell Host & Microbe 27, 601–613
综上所述，本文作者首先通过活性导向天然产物分离鉴定出了拟南芥中异硫氰酸酯类化合物SFN,确证了其抑制植物病原菌III型分泌系统相关基因表达的活性。作者进一步通过化学蛋白质组学鉴定出SFN的靶点蛋白和作用位点，表明了SFN直接结合HrpS蛋白209位的半胱氨酸残基，抑制HrpS和HrpR六聚体的形成，从而抑制了HrpL的表达，使得植物病原菌III性分泌系统相关基因表达受到抑制。通过该生物机制，SFN分子能够特异性的降低病原菌的致病性，而不对益生菌产生毒性，起到了靶向防御的作用。孙子曰：“凡用兵之法，全国为上，破国次之”，通过将病原菌与益生菌区别开来并“解除武装”，植物能够最大限度的保证自身的正常生理活动不受影响，达到“不战而屈人之兵”的抗菌效果。
图片摘自：Wang et al., 2020, Cell Host & Microbe 27, 601–613
在该工作中王伟博士和杨靖研究员为本论文的共同第一作者，雷晓光教授和周俭民研究员为共同通讯作者。褚金芳研究团队和白洋研究团队也参与了这项工作。该工作得到了国家自然科学基金，国家重点研发计划，中国科学院国际合作重点项目，北京市“卓越青年科学家计划”，北京分子科学国家研究中心，植物基因组学国家重点实验室，以及生命科学联合中心的资助。
论文链接：https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(20)30168-2
