尹玉新团队报导磷脂酰肌醇二磷酸PIP2调控pH调节蛋白AE2活性的机制
2024年1月26日，北京大学基础医学院系统生物医学研究所、生命科学联合中心尹玉新课题组在《Nature Communications》在线发表题为“Structural and functional insights into the lipid regulation of human anion exchanger 2”的研究论文，报导了阴离子交换蛋白（Anion Exchanger）AE2的跨膜区与PIP2的复合体结构以及PIP2结合位点突变AE2的全长高分辨冷冻电镜结构，并揭示了细胞膜上脂质分子PIP2对AE2活性调控的机制。
细胞内pH受严格调控以维持在膜兴奋性、细胞骨架动力学和囊泡运输中起关键作用的蛋白质的结构和功能。除氢离子转运体外，SLC4和SLC26两个家族是仅有的转运碱性离子HCO3-的转运体家族。SLC4家族共有10个成员，根据钠离子依赖性和转运电化学特征可分为三类，其中AE1-3（SLC4A1-3）是不依赖Na+的阴离子（Cl–/HCO3–）交换转运体，而AE2组织分布最为广泛，参与骨重吸收、胃酸分泌 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 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 2 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 和胆碱分泌 ADDIN EN.CITE Concepcion2013151515[17]Concepcion, A. R.Lopez, M.Ardura-Fabregat, A.Medina, J. F.Division of Gene Therapy and Hepatology, Center for Applied Medical Research (CIMA), School of Medicine, University of Navarra, and Ciberehd Pamplona, Spain.Role of AE2 for pHi regulation in biliary epithelial cellsFront PhysiolFront Physiol41342014/01/31Cl-/HCO-3 anion exchangebile flowbiliary HCO-3 secretioncholangiocytesprimary biliary cirrhosis20131664-042X (Print)
1664-042X (Electronic)
1664-042X (Linking)24478713https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24478713PMC389445110.3389/fphys.2013.004133等生理活动，AE2敲除小鼠模型出现骨硬化症、无牙齿萌出、胃酸缺乏、雄性不育、胆管损伤等多种表型。AE2的功能异常也会导致人的骨硬化和原发性胆管炎的发生。AE2活性受环境pH、NH4+和渗透压等因素调节，其跨膜结构域（TMD）和胞内N端结构域（NTD）分别参与感受不同因素的调控。
细胞膜蛋白处于被脂质包围的环境，其活性受脂质调节的机制一直是研究热点，离子通道的相关研究远比转运蛋白的丰富。以往对SLC4家族的研究发现，PIP2能增强它NBCe1（SLC4A4）的功能。然而，2018年和2021年报导的SLC4家族成员NBCe1（SLC4A4）和NDCBE（SLC4A8）的冷冻电镜结构并未观察到PIP2的结合。2023年报导的AE1复合体的结构发现PIP2与AE1（SLC4A1）同源二聚体结合，但未进一步研究PIP2对其功能的影响。尹玉新课题组2023年近期报导的SLC4家族成员BTR1（SLC4A11）的PIP2复合体结构显示PIP2结合位点突变的BTR1构象与酸性环境中BTR1构象相似，提示了PIP2和pH对转运体调控的相关性。而AE2作为不依赖Na+的阴离子（Cl–/HCO3–）交换转运体，其感受pH调控的机制以及PIP2是否参与调控AE2活性的调节尚不清楚。
研究人员通过解析AE2结构发现了结合在跨膜结构域二聚体相互作用界面的PIP2分子。此状态AE2无明显的N端胞内结构域密度，跨膜结构域处于inward-facing状态。PIP2结合位点主要由TM7以及TM12和TM13之间的HL螺旋上氨基酸组成，与之前报导的AE1复合体结构中PIP2位置一致。研究人员在AE2的PIP2结合位点引入突变并对其活性进行检测，结果显示TM7上的R932和HL上的K1147以及H1148突变导致AE2转运活性显著减弱。药物处理降低细胞膜上PIP2的水平同样导致AE2的转运活性显著减弱，表明PIP2对转运体活性起激活作用。
随后，通过解析PIP2结合位点突变的AE2（R932A/K1147A/H1148A），研究人员发现此状态AE2的N端胞内区结构域和跨膜结构域存在明显的相互作用，构象与酸性环境中抑制状态的AE2结构相似。PIP2缺失引起TM7胞内侧部分发生明显位移，TM10和TM11之间的β折叠与N端结构域相互作用，协同将跨膜区构象稳定在inward-facing状态。
综上所述，研究者们通过解析不同状态的AE2冷冻电镜结构，发现了AE2的激活因子PIP2，并且从原子水平观察到了PIP2如何调控AE2跨膜区和胞内区的构象变化，为进一步研究AE2的调控机制提供了结构基础。
北京大学基础医学院系统生物医学研究所/生命科学联合中心尹玉新教授为论文通讯作者。北京大学基础医学院博士研究生张炜奇及北京大学基础医学院博士后丁典、吕祎硕为该研究论文的共同第一作者。该研究的冷冻电镜样品制备、筛选和采集在北京大学冷冻电镜平台和北京大学电镜室完成，数据处理获得了北京大学CLS计算平台及未名超算平台的硬件和技术支持，蛋白活性检测在天然药物及仿生药物国家重点实验室成像平台完成。该课题得到国家重点研发计划，国家自然科学基金重点项目以及林松年系统生物医学基金会和生命科学联合中心的支持。
原文链接: https://www.nature.com/articles/s41467-024-44966-0
ADDIN EN.REFLIST 1 Casey, J. R., Grinstein, S. & Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat Rev Mol Cell Biol 11, 50-61, doi:10.1038/nrm2820 (2010).
2 Gawenis, L. R. et al. Mice with a targeted disruption of the AE2 Cl-/HCO3- exchanger are achlorhydric. J Biol Chem 279, 30531-30539, doi:10.1074/jbc.M403779200 (2004).
3 Concepcion, A. R., Lopez, M., Ardura-Fabregat, A. & Medina, J. F. Role of AE2 for pHi regulation in biliary epithelial cells. Front Physiol 4, 413, doi:10.3389/fphys.2013.00413 (2013).
4 Romero, M. F., Chen, A. P., Parker, M. D. & Boron, W. F. The SLC4 family of bicarbonate (HCO(3)(-)) transporters. Mol Aspects Med 34, 159-182, doi:10.1016/j.mam.2012.10.008 (2013).
