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Nature Methods | 红绿双全——李毓龙实验室升级五羟色胺探针实现超高灵敏度的双色成像

2024-03-05 点击：

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Nature Methods | 红绿双全——李毓龙实验室升级五羟色胺探针实现超高灵敏度的双色成像

五羟色胺（5-HydroxyTryptamine，5-HT）也被称作血清素（serotonin），是一种重要的单胺类信号分子，参与多种生理功能的调节。在中枢神经系统中，5-HT信号的失调与多种脑部疾病相关，如抑郁症、焦虑、成瘾、偏头痛和癫痫等。目前，多种治疗精神疾病的药物靶向5-HT能系统，如5-HT再摄取抑制剂“百忧解”（fluoxetine，氟西汀）已被广泛用于治疗抑郁症。在活体动物中对5-HT动态变化的高时空分辨率检测对深入理解5-HT能系统在各种生理病理过程中的调控规律具有重要意义。

2024年3月5日，北京大学、北大-清华生命科学联合中心李毓龙实验室在Nature Methods杂志在线发表了题为“Improved green and red GRAB sensors for monitoring spatiotemporal serotonin release in vivo”的研究论文，基于GRAB探针策略（GPCR-Activation Based Sensor）成功开发出了全新的红色5-HT荧光探针和新一代绿色5-HT荧光探针，并通过光纤记录和大视场成像等方式实现了在活体小鼠多脑区、多行为范式下对5-HT和其它信号的同时检测。实现了从“看得见”到“看得清、看得多、看得广”的突破。

待改进的“看得见”：虽然此前已有几款可遗传编码的5-HT绿色探针被报道，一些条件下能够观察活体动物中的5-HT动态变化，但是现有探针反应大小（即荧光亮度变化程度）与亲和力（即与配体的结合能力）两者“鱼与熊掌不可兼得”，灵敏度还有待提升。

李毓龙团队将已有的神经递质探针中的荧光报告模块移植到不同5-HT受体亚型中，通过不断迭代优化开发了新一代的5-HT绿色探针g5-HT3.0和全新的红色探针r5-HT1.0（图1）。

图1. 改进的绿色5-HT探针和全新的红色5-HT探针的开发与刻画

为了以更高的灵敏度“看得清”5-HT的动态变化，g5-HT3.0结合了高亲和力和高反应两个优点。体外平行对比实验表明，相较于亲和力较高的g5-HT1.0，g5-HT3.0的最大反应约是它的6倍，同时保持了较高的亲和力；相较于反应较大的iSeroSnFR，g5-HT3.0在亲和力方面提升了约13000倍，在纳摩尔至毫摩尔数量级的五羟色胺浓度范围内表现出更大的反应。

为了在神经化学信号种类上“看得多”，r5-HT1.0能与其它绿色荧光探针进行双色成像，实现了不同信号的同时检测。本研究中在小鼠基底前脑（Basal Forebrain，BF）同时记录了5-HT能神经元轴突的钙活动（绿色GCaMP6s）以及轴突释放的5-HT（红色r5-HT1.0）的动态变化，发现二者存在很高的相关性（图2）。

图2. 光纤双色记录基底前脑的5-HT和5-HT能神经元轴突钙信号

为了在成像区域上“看得广”，本研究结合大视场荧光成像技术和新的g5-HT3.0探针，实现了大尺度、多脑区的5-HT实时监测。首次在小鼠背侧皮层监测到了不同条件下的5-HT释放特征，如发现了睡眠觉醒周期存在5-HT水平的动态变化，尤其是非快速眼动睡眠（non-rapid eye movement，NREM）期间的震荡，而同一时刻不同脑区则展现出相对均一的变化（图3）。结合双色成像进一步发现，在癫痫的病理条件下，背侧皮层存在着5-HT“波”的传播，并且5-HT“波”紧随着钙“波”或者内源大麻素“波”进行传播。以上结果展现了5-HT在大脑不同状态下具有空间特异性的调控特征，为深入理解其功能提供了有力的工具。

图3. 睡眠觉醒周期小鼠背侧皮层5-HT的时空动态

视频1. 小鼠癫痫模型中5-HT和钙“波”的传播

视频2. 小鼠癫痫模型中5-HT和内源大麻素“波”的传播

综上，本研究开发了全新的红色5-HT探针和灵敏度大幅提升的绿色5-HT探针，并且使用这些探针研究了不同生理和病理过程中5-HT的时空动态特征，实现了活体动物中5-HT动态监测的突破——即从“看得见”到“看得清”、“看得多”和“看得广”，加深了对5-HT能系统的了解。这些探针也将为相关领域的研究提供强有力的工具，进一步推动新的科学发现与见解的产生。

北京大学生命科学学院李毓龙教授为该论文通讯作者；北京大学生命科学学院邓飞博士（现为深圳湾实验室分子生理学研究所博士后）和万金霞博士为共同第一作者。李毓龙课题组董辉博士（现为上海交通大学松江研究院青年研究员）、赵玉琳博士、冯杰思博士、李雪霖博士、李国川、夏西聚、王艺潘、郑宇、鄢羽岐等对文章做出了重要贡献。该工作得到了清华大学自动化系谢浩博士、庄超玮博士等的通力合作。研究得到了膜生物学国家重点实验室、北大-清华生命科学联合中心、国家自然科学基金、北京市科委、生命医学峰基金、宋晨枫与高欣欣公益基金会和新基石科学基金会所设立的新基石研究员项目与科学探索奖等机构和经费的大力支持。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41592-024-02188-8

专家点评

罗敏敏（北京脑科学与类脑研究中心资深研究员）

5-羟色胺（5-HT）在脑中调节几乎所有细胞的活动，参与情绪、食欲、睡眠和认知等行为的调控，且5-HT水平失衡与抑郁、焦虑等情绪障碍相关。因此，实时灵敏地监测5-HT的动态变化对于理解5-HT能系统的功能、机制和神经精神疾病至关重要。传统方法如药理学、遗传学和钙探针存在无法直接实时监测活体动物5-HT动态变化的局限。李毓龙团队近年开发的绿色5-HT荧光探针可用于检测活体动物中5-HT水平的变化，但灵敏度有限。本研究中，他们开发的新型绿色5-HT荧光探针灵敏度大幅提升，能更灵敏地检测活体小鼠中5-HT的动态变化。结合大视场成像，观测到皮层中5-HT的不同释放特征，推动新现象的发现。首款红色5-HT探针为同时检测5-HT和其他神经递质提供了新选择。期待这些探针帮助研究人员进一步深入理解5-HT的生理功能。

余小丹（中山大学博士后）| 李晓明（浙江大学教授长江学者）

五羟色胺（Serotonin，5-HT）是一种重要的单胺类神经递质，广泛存在于哺乳动物的组织中，分为中枢（大脑）和外周两个系统；其中大脑5-HT系统与精神健康密切相关。大脑5-HT由5-HT神经元合成并释放，调节大脑各个区域的活动，参与多项生理功能，包括情绪与社交、攻击与冲动、运动与静止、睡眠与觉醒、奖赏与惩罚、学习与记忆等(Okaty et al., Nature Reviews Neuroscience, 2019)。临床研究发现：大脑5-HT水平的降低与焦虑、抑郁、冲动、攻击和暴力行为相关，而通过药物提高大脑5-HT水平能够有效缓解焦虑和抑郁情绪(Dayan and Huys, Annual Review of Neuroscience, 2009)。动物实验表明：大脑5-HT水平的降低和5-HT受体的减少会增加动物的攻击行为(Edwards and Kravitz, Current Opinion in Neurobiology, 1997)；大脑的5-HT水平会随着运动-静止的转变、睡眠-觉醒的周期以及奖赏-惩罚的刺激呈现有规律的波动(Liu et al., Neuron, 2014; Seo et al., Science, 2019; Wan et al., Nature Neuroscience, 2021)；5-HT的释放能够调节联想学习中条件-刺激偶联的时间窗(Zeng et al., Neuron, 2023)；我们实验室近年的研究发现，杏仁核的5-HT能够调节焦虑状态下焦虑与社交行为之间的关系(Yu et al., Nature Neuroscience, 2022)。

5-HT神经元在神经环路、电生理特性和刺激响应等多个维度上具有高度的异质性。也就是说，不同大脑区域在不同的行为状态下，5-HT可能具有不同的释放模式。然而，由于传统的电化学检测法缺乏高特异性和高时空分辨率，5-HT释放模式的多样性无法得到证明。如何在体、实时地检测特定脑区的5-HT释放模式，一直是5-HT领域的一大难题。2021年，李毓龙教授团队开发了第一代GRAB5-HT探针（g5-HT1.0），基本实现了大脑5-HT在体、实时、高时空分辨率的检测(Wan et al., Nature Neuroscience, 2021)。然而，g5-HT1.0的信号强度和灵敏度依然不足以揭示5-HT在不同行为状态下的精细释放模式。在本项研究中，李毓龙教授团队对GRAB5-HT探针进行迭代更新，发布了两种新的5-HT探针，分别为红色5-HT荧光探针（r5-HT1.0）和新一代绿色5-HT荧光探针（g5-HT3.0）。其中，与g5-HT1.0相比，g5-HT3.0的反应强度提高了6倍，并保持了较高的亲和力，实现更高的信噪比和更快的时间响应速率。该探针的应用进一步揭示了睡眠-觉醒状态下5-HT的精细动态变化。值得一提的是，我们实验室有幸与李毓龙教授团队合作，利用改进后的绿色5-HT探针对杏仁核中的5-HT信号传递进行探究，发现了5-HT参与不同焦虑行为特征的精细神经环路机制和特异神经分子基础(Yu et al., Nature Neuroscience, 2022)。

5-HT不仅能单独调节神经元的活动，还能通过与其他神经递质相互作用，调控神经元及神经环路的活动。例如，5-HT与谷氨酸通过协同作用，介导奖赏行为(Liu et al., Neuron, 2014)；5-HT通过谷氨酸与γ氨基丁酸实现负反馈调控，进而调控焦虑行为(Yu et al., Nature Neuroscience, 2022)；5-HT对社交奖赏的调控作用受到催产素的影响(Dölen et al., Nature, 2013)。然而，由于缺乏同时记录多种神经递质的实验技术，以往5-HT与其他神经递质相互作用的研究都局限于离体层面。本研究中，李毓龙教授团队开发的红色5-HT荧光探针r5-HT1.0独立于绿色荧光，能够与其他神经递质的绿色荧光探针进行同时、同位点记录，这种方法能够在在体层面上揭示5-HT与其他神经递质的相互作用，具有很好的基础研究应用前景。

本研究中，作者利用介观成像技术，系统地观察了生理（睡眠-觉醒）和病理（癫痫发作）模型中大脑皮层全局5-HT水平的动态变化，提示5-HT在生理和病理状态下发挥功能的时空特异性。介观成像技术与神经递质荧光探针的联合运用，为全面了解神经递质如何协调大脑不同区域的联动提供了强有力的工具。

李毓龙

北京大学生命科学学院教授

北京大学IDG麦戈文脑科学研究所PI

北大-清华生命科学联合中心PI

深圳湾实验室分子生理学研究所合作PI

邮箱：

yulongli@pku.edu.cn

实验室主页：

http://www.yulonglilab.org/

研究领域：

人的大脑由数十亿的神经元组成，后者又通过数万亿的突触组成复杂的神经网络。不同种类的神经元经过或远或近的投射，通过突触与其他神经元进行信息交流，实现感知觉、决策和运动等高级神经功能。

研究大脑的最大挑战在于脑的高度复杂性。我们实验室集中在神经元通讯的基本结构突触上，从两个层面上开展研究：一是开发前沿的工具，即开发新型成像探针，用于在时间和空间尺度上解析神经系统的复杂功能；二是借助先进的工具探究突触传递的调节机制，特别是在生理及病理条件下对神经递质释放的调节。

具体而言，对于工具开发，我们集中于：1）结合光遗传学和荧光成像，无损伤性的研究神经元之间的电突触连接。电突触的异常可导致耳聋、癫痫、脑部肿瘤和心脏功能异常等疾病。2）开发可遗传编码的检测神经递质/调质的荧光探针。神经递质/调质是神经元化学突触传递的关键介导分子，与感知、学习和记忆以及情绪密切相关。

利用上述荧光探针，我们的功能性和生理性的研究集中于：1）结合双光子成像和可遗传编码的荧光探针，使用果蝇和小鼠作为模式生物，研究嗅觉传导或睡眠过程中脑的工作机制。2）寻找上述新型化学递质/调质小分子的对应受体，即寻找“孤儿”受体的配体。3）结合生物信息学、分析化学、生物化学、生理学和成像学方法，系统地探索和鉴定潜在的新型小分子神经递质。

李毓龙实验室长期诚聘不同学科背景的副研究员、博士后及技术员，待遇从优。欢迎对脑科学感兴趣的有志青年加入！