蛋白糖基化是一种重要的翻译后修饰，其修饰的蛋白底物范围和修饰位点由糖基转移酶与受体间的识别决定。酶催化的糖基化定点引入，是获得均一糖蛋白的重要方法，尤其在N-糖基化研究中已成为有效手段之一。细菌来源的糖基转移酶因其易于表达纯化等优良性质，常被改造为人工合成糖蛋白的工具酶。然而与N-糖基化不同，蛋白质O-糖基化通常缺乏严格、明确的识别序列，且O-连接糖基化修饰在原核生物与真核生物之间并不保守，细菌O-糖基转移酶在糖基供体和底物识别范围上与真核生物差距明显，导致通过细菌糖基转移酶向真核蛋白位点特异性引入O-糖基化修饰面临挑战。

2025年7月14日，北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心陈兴/戴鹏团队与北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心肖俊宇团队合作，在Nature Chemical Biology杂志发表题为“Protein β-O-glucosylation by Legionella LtpM via short consensus sequons G-T/S and S-G”的研究论文，报道了嗜肺军团菌效应蛋白LtpM作为β-O-葡萄糖基（β-O-Glc）转移酶的性质和应用。该工作鉴定了LtpM的修饰底物，阐明了其通过识别G-T/S、S-G序列向许多真核蛋白定点引入β-O-Glc修饰的机制。通过LtpM这一定点引入O-糖基化修饰的有力工具，初步揭示了O-Glc替代O-GlcNAc修饰介导液-液相分离的潜力。

在开发O-糖基转移酶的过程中，团队将注意力聚焦在了病原菌效应蛋白上，部分效应蛋白具有糖基转移酶活性，使用真核宿主细胞的糖供体并修真核蛋白底物。在前期发展的α-O-Glc糖基转移酶SetA基础上^[1]，进一步开发了高效、位点特异性引入β-O-Glc修饰的新工具。使用带有生物正交基团修饰的糖供体（尿苷二磷酸-6-叠氮-葡萄糖，UDP-6AzGlc），通过化学酶法策略结合串联质谱，鉴定了嗜肺军团菌效应蛋白LtpM在细胞裂解液中的修饰底物（图1）；在853个底物蛋白上鉴定到1176个修饰位点，发现LtpM严格识别G-T/S、S-G序列。核磁共振表征证实LtpM催化形成的是β-O-Glc修饰。通过X射线晶体结构研究、分子模拟与生化表征，团队探究了LtpM的催化机理和对蛋白底物的识别机制。LtpM糖基供体结合口袋上方存在F166、Q167、W228和K225四个氨基酸残基作为门控位点（gatekeepers），形成了狭窄的底物蛋白通道，从而严格限定所修饰的丝氨酸/苏氨酸相邻残基必须为甘氨酸这一侧链最小的氨基酸。

LtpM独特的两氨基酸识别序列（G-T/S、S-G）使其成为一种有力的糖基化研究工具，在包括天然Notch蛋白在内的众多靶蛋白底物上实现了位点特异性β-O-Glc标记。对于不符合该识别序列的目标修饰位点，可通过插入或突变单个甘氨酸残基实现修饰，减少了引入长识别序列带来潜在蛋白结构干扰。基于对糖基供体底物修饰的容忍性，使用UDP-6AzGlc作为糖基供体，LtpM实现了位点特异性地向目标蛋白质引入生物正交基团并进一步偶联各种功能探针，为生物偶联提供了新方法。

图1. LtpM严格识别G-T/S、S-G序列实现β-O-Glc修饰的定点引入。

考虑到β-O-Glc修饰与O-连接的β-N-乙酰氨基葡萄糖（β-O-GlcNAc）这一重要糖基化修饰的结构相似性，团队提出O-Glc有望作为不被OGA水解的O-GlcNAc功能替代物（functional surrogate）发挥作用这一科学假设，并使用LtpM定点引入O-Glc加以阐释验证。SynGAP蛋白T1306位的O-GlcNAc修饰通过阻断其与PSD-95蛋白的相互作用，抑制两者液-液相分离过程^[2]。通过LtpM高效地向SynGAP T1306位点特异性引入O-Glc修饰和相分离表征，揭示了O-Glc替代O-GlcNAc介导液-液相分离的潜力。

综上所述，这项研究实现了对军团菌效应蛋白LtpM的底物鉴定、酶结构解析和催化识别机理研究，揭示了独特的两氨基酸识别序列。该工作为带有β-O-Glc修饰糖蛋白的精准合成和该修饰的功能研究提供了高效的标记新工具。

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研究兴趣： 

化学与生命科学的交叉融合为分析、理解和操控生物学过程开辟了一条全新的研究途径。我们课题组的研究兴趣集中于化学糖生物学和生物纳米技术。我们综合运用化学方法、生物手段和纳米技术，研究糖基化的生物学功能及其在代谢疾病及其心血管并发症中的作用。主要研究内容包括：

1. 活细胞及活体中聚糖的化学标记

2. 糖的合成、成像和组学分析

3. 糖基化在神经系统和干细胞中的功能

4. 糖代谢与糖基化的内在联系

5. 基于生物正交反应的化学生物学技术

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junyuxiao@pku.edu.cn

研究领域： 生物化学、结构免疫学

肖俊宇实验室致力于研究与人体疾病密切相关的蛋白机器。2014年回国独立组建实验室后，首先基于之前的研究积累开展了对分泌途径内新型激酶的系统研究，揭示了它们活性调节和底物识别的机制。近年来，更加聚焦对免疫球蛋白的研究，阐明了IgM分子的组装机制，揭示了IgA二聚体的结构细节及其被肺炎链球菌蛋白特异性识别的机理。自新冠疫情爆发以来，积极投身抗疫工作，阐明了一系列高活性新冠病毒中和抗体的结构，系统分析了它们的识别表位、分类特征、配对策略及对不同突变株的应答情况。