近日，北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心、北大成都前沿交叉生物技术研究院王初课题组在Journal of the American Chemical Society杂志上发表了题为“Site-specific Profiling of RNA-binding Proteins Enabled by Isotopic Signature Enhanced Mass Spectrometry”的文章。在这项工作中，作者基于课题组此前发展的特殊同位素信号质谱靶向方法isoSTAR（isotopic signature targeted profiling），开发了名为isoRIC（isotopic signature targeted RNA interactome capture）的位点特异性的RNA结合蛋白组学鉴定新方法，并利用此方法发现了调节RNA-蛋白相互作用的关键氨基酸位点。

RNA结合蛋白（RBP）在RNA的剪接、定位、降解等转录后调控中扮演着核心角色，其功能异常与许多疾病的发生发展密切相关。然而，如何精准、全面地捕捉动态变化的RNA-蛋白相互作用，尤其以单氨基酸分辨率精确绘制RNA-蛋白互作的相互作用界面，一直是领域内面临的巨大挑战。目前，在组学水平上鉴定RNA蛋白结合位点的方法通常依赖于紫外交联并结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）。在质谱数据依赖性采集（Data-Dependent Acquisition, DDA）模式下，部分肽段离子仅会按强度由高到低顺序被选择进行碎裂及二级谱扫描，这会导致低丰度、负电荷基团多的核酸交联肽段离子很难被检测到。此外，交联产物的异质性（如连接着单、双、三核苷酸的修饰形式）和假阳性问题，也为RNA交联肽段的精确鉴定带来了巨大困难。

面对上述挑战，作者将课题组此前开发的实时同位素信号靶向分析技术（isoSTAR）（号外 | 王初课题组基于特殊同位素信号开发质谱靶向检测新方法、发现新修饰）与同位素编码的非天然核苷代谢标记相结合，开发了同位素靶向的RNA互作位点鉴定（isoRIC）的新方法。首先，作者设计并合成了在尿嘧啶2-O位进行部分¹⁸O取代（¹⁶O:¹⁸O = 1:2）的光活性核苷4-硫代尿苷（4-SU）。这种同位素4-SU能够被细胞代谢并掺入新合成的RNA中。当用紫外光诱导RNA与蛋白质交联后，所有与RNA交联的肽段都会携带上一个独特的“分子身份证”——一个分子量+2 Da的稳定同位素质量偏移特征。其后，利用同位素编码靶向的isoSTAR技术即可实时监控质谱一级谱（MS1），一旦检测到带有上述特定同位素特征的离子，系统会立即触发二级质谱（MS/MS）扫描，实现对目标交联肽段的“精准打击”。这种策略彻底摆脱了对离子强度的依赖，使得即使含量极低的交联肽段也会被精准靶向鉴定。

通过严格的实验验证，isoRIC展现出了超越传统DDA方法的优越性能：（1）更高的检测灵敏度：在重复实验中，isoRIC鉴定到的RNA结合蛋白（RBP）和RNA-交联肽段数量均显著多于DDA。（2）更高的鉴定准确性：基于MS1和MS2水平上稳定的同位素特征，isoRIC能够有效排除非特异性吸附肽段的干扰，将搜索范围聚焦于真正的交联肽段，从而大幅提升结果的可靠性。（3）成功验证新靶标：研究团队通过免疫印迹实验，成功验证了isoRIC新发现的一系列非经典RBP，拓展了RNA结合蛋白质组的疆域。

凭借其高分辨率，isoRIC不仅可以帮助研究者发现新的RBP，更深入揭示了其RNA相互作用界面上的“热点”残基。在与神经退行性疾病相关的TDP-43蛋白中，isoRIC精准定位了RNA交联位点K263。该位点邻近RNA结合域，其突变（K263E）与额颞叶痴呆等疾病相关。功能实验表明，将带正电的K263突变为带负电的谷氨酸会完全破坏TDP-43与RNA的结合，而保守突变（K263R）则影响甚微。这从分子层面解释了为何此类点突变会引发严重的病理后果。

isoRIC的另一大应用是可以从位点水平层面研究RNA结合蛋白上的翻译后修饰（Post-translational modification, PTM）对其RNA结合能力的直接影响。作者发现，在与炎症响应调控相关的RNA结合蛋白YBX1中，其RNA交联位点K137同时也是一个已知的琥珀酰化（succinylation）位点，这种修饰会将赖氨酸的正电荷转为负电。因此当作者使用琥珀酸盐处理细胞以提高琥珀酰化水平时，YBX1的RNA结合能力随之下降，而抵抗琥珀酰化的突变体K137A则完全消除了其对于琥珀酸盐的敏感性。在LPS刺激巨噬细胞时，细胞的TCA循环会大大加快，并提高内源性的琥珀酸水平。作者在这一场景中也观察到了YBX1的RNA结合能力下降，而K137A的突变体则不受影响。这一系列实验表明了YBX1上的K137作为一个关键的RNA结合位点，可以通过感知代谢重编程时的内源代谢物浓度变化而调节RNA结合能力的重要作用。

总之，本工作开发的isoRIC通过结合同位素光活性核苷代谢标记和同位素实时靶向质谱，全面鉴定了RNA-蛋白互作界面上的RNA结合位点。该方法不仅显著提升了RNA结合蛋白及其结合位点的鉴定数量和准确性，还进一步帮助我们深入理解了疾病相关突变的功能影响和PTM调控RNA蛋白互作中精密机制。目前，isoSTAR适用于Thermo Fisher旗下的Q Exactive系列及Tribrid系列质谱仪，学术用户向Thermo Fisher公司免费申请IAPI许可后，可在github.com/wangchulab/isoSTAR查看并获取isoSTAR可执行程序。

本文通讯作者为北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心、北大成都前沿交叉生物技术研究院的王初教授，共同第一作者为王初课题组化学学院博士研究生刘亦成及博士毕业生贾国赓。王初课题组的博士研究生冯天宇、李成蹊及北大成都前沿交叉生物技术研究院的肖伟弟博士也为此课题的完成做出了重要贡献。王初课题组的毕业生张锦博士也为本课题的流程开发提供了帮助。该工作得到了科技部重点研发计划、国家自然科学基金、北京分子科学国研中心等项目的支持。