陈知行团队发明新一代高亮度高光稳定性罗丹明活细胞荧光探针
近年来，在生物成像领域涌现了一批新兴的高/超分辨显微技术，结合仪器和算法的创新，实现了对细胞生理活动的3D长时程动态全景记录。得益于超前的学科布局及跨学科团队的长期耕耘，生命科学联合中心在成像组学领域取得了一批代表性成果，为生物医学相关学科的研究提供了颠覆性工具：如程和平院士领衔开发的微型化双/三光子显微镜实现自由移动小鼠脑组织深层成像、陈良怡教授团队报道超灵敏结构光超分辨显微镜及算法系统研究细胞及胰岛组织中的生理病理过程、李毓龙教授团队系统性地创造了可遗传编码的神经递质探针为神经生物学研究提供无可替代的前沿工具、邹鹏研究员团队发展高性能混合型膜电压探针研究可兴奋细胞生理活动、邓伍兰研究员课题组则长期运用单分子荧光成像研究基因调控的时空动态。这些振奋人心的进展同时也对荧光探针这一成像组学核心基础工具的性能提出了更高的要求。可以说，开发更亮更稳定更高生物相容性的新一代化学合成活细胞荧光探针，将决定成像技术的性能极限，成为精确可视化细胞的时空动态和信号调节的基础设施。
化学合成的荧光探针相比于荧光蛋白而言，其亮度与光稳定性都具有明显优势。现有化学荧光探针工具包光谱横跨紫外可见至近红外波段，并与生物大分子标记策略共同迭代，以满足动态成像组学对复杂生物样本中总光子输出及高效多通道标记日益增长的需求。高亮度、优异的光、化学和光谱稳定性（抗光蓝移）、适当的亲水性以及优异的生物相容性是顶级荧光探针的理想特征。例如，近十年来美国HHMI Janelia Farm研发的JF系列荧光染料以其较高的亮度，在活细胞标记、超分辨成像以及功能探针领域获得了关注，形成了垄断的技术壁垒。然而，以JF系列为代表的现有的化学荧光探针的光稳定性和生物相容性的优化并不理想。能否通过光物理化学原理创新，开发同时具备高亮度、高光稳定性和优异的生物相容性的“全能型”荧光团，在多个重要核心参数上建立全面的优势，是本领域亟待解决的技术难题。
2025年5月19日，北京大学未来技术学院、北大-清华生命科学联合中心陈知行团队在Nature Methods杂志发表了题为A Palette of Bridged Bicycle-Strengthened Fluorophores的研究文章，提出了以氧或砜取代氮杂[3.2.1]桥环为助色团创制高性能荧光探针的集成化、模块化通用设计策略，构建了一系列光谱横跨紫外和可见光范围的BD（Bridged Dye）系列高性能生物相容性染料，并与HaloTag蛋白质标签技术结合实现了不同尺度生物体内特定蛋白的标记及长时程/三维超分辨成像。BD染料拥有优异的亮度及出色的光稳定性，且彻底抵抗光谱蓝移造成的伪影，在单分子成像、固定或活哺乳动物细胞和植物细胞的超分辨率成像（STED和SIM），以及斑马鱼在体成像和基于化学遗传学的电压成像实验中都有良好表现，展现出显著优于已报道JF Fluor、ATTO dye、SiR等先进染料的光子预算及成像时长。
作者从化学原理出发，基于助色团分子工程，综合运用位阻效应、电子效应、Bredt规则、氢键受体调节等策略，结合计算化学等辅助预测手段，设计了新型砜或氧取代氮杂[3.2.1]桥环助色团结构（图1a），将其应用于罗丹明、香豆素、噁嗪等多种荧光母体中（图1b）并对其各项光物理性质进行了详细表征。该助色团有独特的杂原子取代桥联双环体系，通过减小位阻和吸电子诱导，双管齐下抑制扭曲分子内电荷转移（TICT）态的形成，最大程度提升探针亮度（荧光量子产率至高可达0.98）。需要特别指出的是，该桥环独特的化学结构可以从根本上彻底抑制助色团光氧化脱烷基所带来的光谱蓝移现象，实现探针光稳定性的大幅跃升83%-819%（图1c），这对获得更多光子预算、减少多色成像中产生的光谱串扰伪影，及避免荧光探针与蛋白之间的非特异性交联至关重要。
图1 Bridge Dye设计思路、化学结构及光稳定性表征。
BD系列荧光探针不仅具有出色的光学性质，还具有优异的生物相容性。两种类型（砜或氧取代）的助色团含有不同数量的氢键受体，这将使染料具有可调节的水溶性和细胞膜渗透性，以适应体外生物大分子偶联或活细胞标记等多种生物应用场景。作者着重测试了了BD荧光探针的HaloTag功能化衍生物（BD566HTL、BD626HTL和BD666HTL）并在多物种中及跨尺度先进成像设备上展示了其优越性能。BD566HTL和BD626HTL染料与HaloTag蛋白标签共价结合后亮度显著高于现有最先进的JF549、SiR等化学荧光染料（提升14%-64%），是mScarlet3-H等同波段先进红色荧光蛋白亮度的4倍左右。BDHTL系列荧光探针光稳定性相比同波段染料最高可提升20倍（以荧光强度衰减一半所用时间计算），从而对活细胞超分辨长时程多维观测实验产生全面提升。例如BDHTL系列染料在3D/长时程超分辨成像中的表现尤为突出：BD626HTL活细胞STED成像线粒体外膜和细胞骨架动态变化观测时长相较于SiRHTL和JF646HTL提升100%-200%（图2c）；BD626HTL还可以承受超过30帧3D STED图像拍摄从而重构线粒体完整外膜（图2f）。此外，作者还通过解析BD626HTL与HaloTag蛋白复合物的晶体结构发现了荧光探针助色团与蛋白残基间新的极性相互作用，这将对后续基于BD荧光探针开发混合型传感器具有指导作用（图2d）。
图2 BD荧光染料的应用展示。a)北京大学邓伍兰研究员课题组展示了BD566相较JF549的单分子亮度提升19%，追踪时间提升70%；b)北京大学邹鹏研究员课题组展示了BD566版本的细胞膜电压传感器Voltron2相比于JF552版本在灵敏度无显著性差异的情况下光稳定性提高260%; c)BD626活细胞STED成像观测时长相较SiR和JF646提升100%-200%; d) 解析BD626与HaloTag蛋白复合物晶体结构发现荧光探针助色团与蛋白残基间新的极性相互作用; e)中科院脑科学与智能技术卓越创新中心穆宇研究员课题组使用BD566/626实现斑马鱼在体染色标记及全脑神经元3D成像; f)BD626承受超过30帧3D STED图像拍摄从而重构线粒体完整外膜; g)北京林业大学林金星教授课题组展示了BD626在活植物细胞膜蛋白SIM成像中观测时长相较JF646可提升20倍以上；h)北京大学医学部黄小帅研究员与合作者利用BD566在3D-MP-SIM系统中实现长时程3D双色超分辨成像解析线粒体与内质网间的互作。
北京大学未来技术学院2025届毕业生张钧维博士为本论文的第一作者，北京大学、北大-清华生命科学联合中心陈知行研究员为本论文的通讯作者。通讯单位包括北京大学未来技术学院，分子医学研究所，前沿交叉学科研究院，生命科学联合中心，国家成像中心，膜生物学国家重点实验室，代谢及心血管分子医学北京市重点实验室，北京大学分子医学南京转化研究院，南京浦海景珊生物技术有限公司。北京大学博士生张珂诚（染料-蛋白质复合物结构解析）、中科院脑科学与智能技术卓越创新中心王逵博士（斑马鱼在体成像）、北京大学博士生王波（单分子成像）、北京大学博士生朱思彦（膜电压成像）、北京林业大学博士生钱虹萍（植物细胞成像）、BSJ Institute马钰淼（理论计算）为本研究做出了重要贡献。特别感谢中科院脑科学与智能技术卓越创新中心穆宇研究员、北京大学邓伍兰研究员、北京大学邹鹏研究员、北京林业大学林金星教授、北京大学陈雷教授对本工作的大力支持和悉心指导，以及杨有军教授和Lei Wang教授对论文的审阅。本工作得到了科技部国家重点研发计划基金、北京市科学技术委员会基金、北京分子科学国家研究中心开放课题项目基金和国家自然科学基金委员会基金等基金项目的支持。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41592-025-02693-4
