近日，北大-清华生命科学联合中心、北京大学化学与分子工程学院、前沿交叉学科研究院、北大成都前沿交叉生物技术研究院王初教授团队与中国科学院上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心刘聪研究员团队联合在Nature Chemical Biology杂志上合作发表了题为“Quantitative Chemoproteomics Reveals Dopamine’s Protective Modification of Tau”的研究文章。在这项工作中，作者发展了定量化学蛋白质组学策略对鼠脑中的多巴胺修饰位点进行了全局性的解析，并揭示了多巴胺修饰在调节Tau功能中发挥保护作用。

多巴胺（DA）是一种重要的神经递质，在神经活动的调节过程中发挥重要作用。已有研究表明，DA能够通过Michael加成的方式共价修饰到底物蛋白上，影响蛋白质的功能，但是我们对DA功能的认识仍有待深入。在中枢神经系统中，DA的合成、转运和释放受到严格控制，这主要是由于儿茶酚胺结构很容易被氧化产生一系列亲电产物，包括多巴醌（DAQ）、多巴胺色素（DAC）和5,6-吲哚醌（DHIQ），它们可以通过Michael加成与蛋白质上的亲核残基（如半胱氨酸、赖氨酸和组氨酸）反应，形成多巴胺修饰（为了有别于多巴胺氨基在组蛋白H3谷氨酰胺上通过TGM2酶介导的转氨化反应所产生的“Dopaminylation”, 在本工作中将该类Michael加成修饰称为“Dopamination”）。这种修饰可能通过改变蛋白质的结构和功能影响细胞状态，从而参与到疾病的发生发展过程中。研究表明，过量的细胞质DA，如果不能很好地保留在突触囊泡中或被分解代谢酶及时清除，将通过这种氧化修饰导致神经毒性作用，可能与神经退行性疾病（NDs）的发病机制有关。破译多巴胺引起的修饰有利于帮助作者了解多巴胺在一些神经退行性疾病中发挥的作用，进一步揭示神经退行性疾病发生发展的分子机制，并针对该过程开发有助于延缓疾病进程的药物。

目前已经开发了几种方法来鉴定蛋白质组中被多巴胺修饰的蛋白质，例如放射性同位素标记法、氨基苯基硼酸琼脂糖（PBA）富集法、亚硝基蓝四唑(NBT)/甘氨酸氧化还原循环染色法、近红外光谱法。但是，这些方法的通量以及灵敏度都比较有限，而且无法提供准确的多巴胺修饰位点信息。考虑到多巴胺的化学反应性质使其更容易发生在半胱氨酸（特别是活性半胱氨酸）上，基于半胱氨酸特异性探针的化学蛋白质组学技术有潜力以位点特异性的方式定量全局的Dopamination。在这项工作中，作者首先利用酪氨酸氧化酶体系验证了多巴胺能够以浓度梯度依赖的形式有效竞争蛋白质组中半胱氨酸选择性探针IA-alkyne的标记信号。随后，作者使用基于DIA的竞争性ABPP策略，对Dopamination位点进行了全面的化学蛋白质组学分析，准确测定了DA对蛋白质组中6000多个活性半胱氨酸的半有效抑制浓度（IC50），获得了63个Dopamination高敏感位点。

有趣的是，作者在鼠源Tau蛋白（mTau） 上发现了两个超敏感半胱氨酸位点（Cys280和Cys311）。Tau是一种参与微管组装的内在无序蛋白，被认为在神经退行性疾病阿尔兹海默症中发挥关键作用，这两个半胱氨酸位于Tau的微管结合区域且高度保守。作者进一步合成并利用生物正交的多巴胺类似物探针DAyne以及利用同位素标记的多巴胺交叉验证了Tau半胱氨酸上的Dopamination。此外，作者利用NMR技术获得了Dopamination对Tau蛋白微管结合区域结构的影响，揭示了Dopamination显著影响Tau蛋白微管结合区域中淀粉样蛋白VQIVYK片段。

基于结构的数据，作者接下来研究了多巴胺是否可以直接调节Tau的淀粉样蛋白聚集和Tau介导的微管组装过程。这些结果表明，Tau中两种半胱氨酸的Dopamination不仅可以阻止淀粉样蛋白聚集，还可以增强其促进微管蛋白组装成微管的生理功能。

在确认了Dopamination在Tau蛋白上的外源性结构和功能后，作者希望可以在内源的组织样本中鉴定到。最初，作者按照DA加成到半胱氨酸上产生的质量位移（DA, +151.06 Da）进行检索，无法获得可靠的修饰位点鉴定信息。考虑到多巴胺容易氧化的性质，作者尝试将氧化形式的Dopamination也加入到数据检索的修饰类型中。最终，作者发现在内源的鼠脑中，Dopamination主要以DAQ/LDAC (+149.05 Da) 的形式存在（结构见图1）。为了进一步验证鉴定结果的可靠性，作者合成了修饰多肽的标准品，利用LC-MS/MS共流出以及串联质量标签（TMT）载体策略，在一级质谱和二级质谱层面验证了内源DAQ/LDAC修饰的存在。可靠的质谱数据充分证明了内源Dopamination修饰的存在。未来的研究中，作者计划对不同年龄老鼠脑中的Dopamination修饰进行鉴定一级定量，以进一步发掘Dopamination修饰的生理功能。

总而言之，本工作开发了一个基于DIA-ABPP的定量化学蛋白质组学平台大规模鉴定和定量小鼠脑蛋白质组中的Dopamination位点，证明了Tau蛋白高保守半胱氨酸上存在内源性Dopamination，这种修饰在体外能够抑制Tau蛋白淀粉样原纤维化并促进Tau介导的微管组装，具有保护作用。该研究不仅绘制了DA修饰在脑组织中的全局性图谱，而且发现了DA在调节Tau功能中的保护作用，这加深了研究者对DA在人类生理和病理功能的理解对于靶向Tau的药物研发具有重要指导意义。

本文的通讯作者为北大-清华生命科学联合中心、北京大学化学与分子工程学院、前沿交叉学科研究院、北大成都前沿交叉生物技术研究院的王初教授，中国科学院上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心的刘聪研究员以及北京大学成都前沿交叉生物技术研究院肖伟弟博士。北京大学化学与分子工程学院王初课题组2018级毕业生王倩雯博士、上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心刘聪课题组2019级毕业生刘正涛博士、北京大学化学与分子工程学院王初课题组2023级博士研究生王右葭为共同第一作者。王初课题组的刘源博士、陈影博士、杨帆博士，刘聪课题组的张胜男博士，上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心贺焯皓研究员和该课题组2019级博士研究生曾文以及上海交通大学的李丹教授也为本工作做出了重要贡献。该工作得到了科技部重点研发项目、国家自然科学基金、四川省自然科学基金、北京分子科学国家研究中心等项目的支持。