研究团队利用单细胞转录组测序技术（scRNA-seq）对12例在复旦大学附属肿瘤医院大肠外科接受原发癌和腹膜转移癌同期手术切除的同时性结直肠癌腹膜转移患者的48个配对样本（包括原发灶CRC、正常结肠组织、腹膜转移病灶PM、正常腹膜组织等）进行了全面解析（图1），构建了CRC-PM的单细胞全景图谱。结果显示：相对于正常结直肠组织，结直肠肿瘤微环境中中性粒细胞大量富集，并且发挥黏膜免疫关键作用的IgA浆细胞和上皮内淋巴细胞显著缺失；相对于正常腹膜组织，腹膜肿瘤微环境中间充质干细胞和中性粒细胞明显减少，而成纤维细胞大量聚集。对肿瘤细胞在两个微环境中差异的进一步分析表明，随着肿瘤细胞由肠道微环境转移至腹膜微环境，其转录谱从“肠上皮细胞特征+炎症表型”逐渐转变为“间充质表型”。
研究进一步发现，在结直肠癌微环境中，大量中性粒细胞高表达微生物模式识别受体NLRP3，同时黏膜免疫细胞的缺失提示该微环境内存在微生物失调。通过独立队列的16S rRNA测序、FISH染色及多色免疫荧光（mIHC）分析，进一步证实了肠道肿瘤微环境中黏膜免疫崩溃和微生物紊乱的情况。基于中性粒细胞在结直肠和腹膜微环境中完全相反的富集形式，研究人员推测这两处微环境的中性粒细胞功能可能截然不同：在结直肠肿瘤微环境中富集的中性粒细胞具有促肿瘤表型，而在腹膜微环境中缺失的中性粒细胞则可能具有抗肿瘤功能。转录组分析显示，结直肠肿瘤微环境中富集的中性粒细胞中NFKB1转录因子高度激活，而腹膜转移微环境中缺失的中性粒细胞则以STAT4转录因子高激活为特征（图2）。细胞共培养实验证实，NFKB1激活的中性粒细胞能够促进肿瘤生长，而STAT4激活的中性粒细胞则可抑制肿瘤生长。基于这些实验结果，研究人员提出在结直肠癌微环境中由促肿瘤表型中性粒细胞、炎症表型肿瘤细胞、黏膜免疫崩溃和微生物紊乱共同构成了一个炎症性正反馈回路，持续推动肿瘤进程。
图2.CRC-PM中不同功能中性粒细胞分布
另一方面，在腹膜肿瘤微环境的单细胞转录组分析中发现，大量富集的成纤维细胞高表达间皮细胞标志物MSLN，轨迹演化推测其来源于间皮细胞的间充质转化(MMT, mesothelial-to-mesenchymal transition)。由于肿瘤细胞在入侵腹膜的过程中也表现出显著的间充质转变，研究者推断肿瘤细胞与间皮细胞在接触过程中协同发生间充质转化。多色免疫荧光以及间皮细胞-肿瘤细胞共培养实验均验证了两者的共定位、间充质转化与彼此的生长促进。进一步的单细胞转录组分析显示，间充质干细胞特异性表达的孤儿趋化因子配体CXCL14可能与正常腹膜中中性粒细胞的富集有关；趋化实验表明CXCL14能够趋化中性粒细胞，而mIHC分析则证实了正常腹膜中CXCL14表达的间充质干细胞与中性粒细胞共定位。上述结果共同揭示了被重塑的腹膜肿瘤微环境：当肿瘤细胞侵入后，大量来源于间皮细胞间充质转化的成纤维细胞改变了原有腹膜基质结构，同时间充质干细胞数量大量减少，导致其表达的中性粒细胞趋化因子CXCL14含量下降，从而无法有效招募抗肿瘤中性粒细胞，最终助长了肿瘤的生长与扩散。
基于上述发现，研究团队提出了靶向MSLN+间皮细胞干预间皮-间充质转化（MMT）从而抑制腹膜转移的治疗策略。通过在体外共培养实验中应用抗MSLN抗体（anti-MSLN），研究发现该治疗可有效抑制间皮细胞向成纤维细胞转化，并降低肠癌细胞的侵袭能力。研究团队进一步在两种CRC-PM的小鼠模型中，证实了MSLN抗体治疗显著抑制腹膜转移癌的发生和发展（图3）。
该研究提出了一个全新的结直肠癌腹膜转移模式：肿瘤细胞在转移过程中经历了转录组层面的表型转变，先在结直肠微环境中展现上皮与炎症特征，继而在腹膜微环境中呈现明显的间充质特征；同时，两个不同的肿瘤微环境也各自经历了重大重塑，从而为肿瘤在两个部位的生长和扩散创造了有利条件（图4）。这些细胞与分子层面的发现为结直肠癌腹膜转移的临床干预提供了新的思路与潜在靶点。
