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数据依赖性采集（Data-Dependent Acquisition，DDA）是基于质谱的蛋白质组学中最常用的检测方法之一，然而由于质谱扫描速度的限制，其仅会按强度由高到低顺序选择部分肽段离子进行碎裂及二级谱扫描，导致强度较低的肽段离子很难被检测到。此前本课题组曾开发了基于硒同位素的靶向组学分析方法SESTAR（号外 | 王初课题组发展基于硒同位素印记的靶向组学分析方法）和SESTAR++(号外 | 王初课题组发展高速识别硒同位素印记的算法)，可以在质谱一级谱数据中选择性识别出可能含硒肽段的同位素信号，并在下一次检测中利用平行反应监测（Parallel Reaction Monitoring，PRM）等靶向鉴定模式对含硒肽段进行靶向鉴定，从而提升含硒肽段的鉴定效果。然而此方法需要两轮质谱检测才能完成，会造成检测时间及样品的浪费，并且因两次检测间的不平行造成通量减少甚至靶标丢失。

在本工作中，作者希望能在SESTAR基础上开发出基于同位素特征的质谱靶向检测新方法，一步即可实现高通量的靶向检测。Thermo Fisher公司在其旗下的Orbitrap质谱仪器上提供了质谱控制接口IAPI，可以较自由地编程实现自定义质谱扫描方法。利用该IAPI接口，本文作者开发了质谱控制程序，可以实现实时读取质谱扫描时传出的数据流，同时利用快速同位素特征识别算法SESTAR++对靶标肽段硒同位素信号进行实时识别，并立即向质谱发出靶向扫描请求。相较于按照强度选择待检测肽段离子的DDA而言，此方法直接使用特征同位素信号筛选待检测离子，从而可以直接对低丰度靶标肽段进行深度的靶向检测。考虑到方法的普适性，作者将SESTAR++算法扩展到可以识别包括硒同位素信号在内的任意特殊同位素信号，并将此基于特殊同位素信号实时靶向质谱的方法流程命名为isoSTAR。

为了测试isoSTAR的性能，作者使用了含硒肽段的靶向检测进行性能测试，并平行对比DDA及DDA+SESTAR的检测效果。通过将不同浓度含硒标肽掺入复杂蛋白质组样品发现，isoSTAR的检测限比DDA和 DDA+SESTAR的检测限都低，说明此方法具有对含硒肽段优异的靶向检测效果。在实际样品的测试中，isoSTAR也表现出对酸性条件下探针标记和富集后的硒代半胱氨酸肽段优异的检测效果，可完全覆盖其它两种检测方法发现的硒蛋白，并具有更好的重现性。结合开放式搜索（open search）技术，isoSTAR可以发现硒代甲硫氨酸培养大肠杆菌蛋白质组中的六种不同形式的含硒肽段，而相比而言，DDA主要检测到的则是没有修饰的肽段及与硒无关的修饰肽段。鉴于其始终靶向碎裂含硒肽段，isoSTAR在不同时间长度的色谱梯度下也始终具有对含硒肽段最好的检测效果。      

参考isoSTAR对硒代甲硫氨酸代谢过程中造成的不同形式含硒肽段的优异发现能力，作者结合了isoSTAR与open search技术开发了代谢过程引发新型翻译后修饰的发现流程。基于代谢过程中有许多翻译后修饰（PTM）相关的前体及活性中间体，此流程中利用了内源代谢物的生物正交类似物探针进行代谢标记，随后利用带有轻、重甘氨酸1：1混合的脱硫生物素富集标签“GG tag”进行特殊同位素信号的引入及富集，再使用isoSTAR对富集的修饰肽段进行靶向检测。在通过open search技术分析出肽段信息及PTM的质量偏移后，最终利用一级谱及二级谱上的特征同位素信号筛选出可信的PTM进入后续验证流程。

长链脂肪酸及短链脂肪酸相关的翻译后修饰有较多报导（例如棕榈酰化及巴豆酰化等），而中链脂肪酸相关的翻译后修饰则鲜有报导。因此，本文作者利用中链脂肪酸类似物辛炔酸对细胞进行了代谢标记，并利用 “GG tag”进行特殊同位素信号的引入及富集，再利用isoSTAR进行质谱检测。进行开放式数据搜索后发现，isoSTAR数据中稳定存在4种不同质量位移的PTM，分别发生在蛋白质的N端、赖氨酸和半胱氨酸残基上。      

这4种PTM均具有很好的谱图匹配，并且在一级谱及二级谱上都具有明显的特征同位素信号，更加增强了其可信度。其中在蛋白质N端及赖氨酸上的PTM经标肽共流出验证均为此前已知的氨基上的辛炔酰化修饰，区别仅在于蛋白质N端上的酰化修饰伴随着起始甲硫氨酸的切除，从而使其质量偏移相差甲硫氨酸残基的分子量。

而在半胱氨酸上的两种PTM则无法与辛炔酸的直接酰化相匹配，并且通过羟胺反应的测试发现其并不是类似棕榈酰化修饰中的硫酯的结构。作者发现这两种PTM分子量刚好相差28.03 Da，并且它们发生在同样的蛋白及同样的位点上，且都位于线粒体内。这很容易联想到脂肪酸降解相关的β-氧化过程，其中间产物α, β-不饱和脂肪酸可与半胱氨酸的巯基发生Michael加成反应，形成硫醚产物，并且此产物的理论分子量刚好可与发现的PTM分子量相对应。并且由于在下一轮的β-氧化代谢中又会生成少两个亚甲基（28.03 Da）的α, β-不饱和脂肪酸，因此产生一系列相差28.03 Da的PTM。作者通过合成标肽进行共流出实验验证了这一猜想的化学结构，并将此修饰命名为半胱氨酸羧甲基化修饰。      

接下来作者在更接近生理环境的条件下，利用没有生物正交基团的普通脂肪酸进行细胞代谢，力图验证半胱氨酸羧甲基化修饰的存在。基于isoSTAR的检测结果，作者选择了潜在修饰底物NDUF4蛋白进行免疫富集及靶向检测。理论上辛酸β-氧化过程中会逐渐产生8个碳、6个碳的α, β-不饱和脂肪酸，直至最小的4个碳的巴豆酸，最终形成3种半胱氨酸羧甲基化修饰（辛酸化、己酸化、丁酸化修饰）。在辛酸培养的细胞中，作者成功检测到了理论上所有的3种半胱氨酸羧甲基化修饰，并利用标肽共流出对其进行了验证。在高脂培养的细胞模型中，作者也成功发现了脂肪酸β-氧化代谢终产物巴豆酸对半胱氨酸修饰造成的丁酸化修饰，证明了新型半胱氨酸羧甲基化修饰在生理或病理环境下的存在。      

综上所述，本工作开发了一种名为isoSTAR的新型质谱检测方法，其通过特异性的同位素信号直接在质谱扫描过程中识别出靶标肽段进行靶向检测，经测试其具有对靶标肽段优异的靶向检测性能。利用isoSTAR及open search技术，作者还开发了代谢过程中新型翻译后修饰的发现流程，成功发现并验证了脂肪酸代谢产生的半胱氨酸羧甲基化修饰。除了上述应用外，isoSTAR也完全适用于任意特征同位素信号标记的肽段的靶向检测，有望在化学蛋白质组学的检测中发挥重要的作用。目前，isoSTAR适用于Thermo Fisher旗下的Q Exactive系列及Tribrid系列质谱仪，学术用户向Thermo Fisher公司免费申请IAPI许可后，可在github.com/wangchulab/isoSTAR查看并获取isoSTAR可执行程序的方式。      

本文通讯作者为北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心、北大成都前沿交叉生物技术研究院的王初教授，共同第一作者为王初课题组化学学院博士毕业生贾国赓、博士研究生刘亦成及冯天宇。王初课题组本科生张子璇、已出站博士后唐欢、博士毕业生杨帆、高晋君等也为此课题的完成做出了重要贡献。Bruker公司郑利敏工程师为质谱测试提供了帮助。该工作得到了科技部重点研发项目、国家自然科学基金、北京大学AI4S专项等项目的支持。      

邮箱：

chuwang@pku.edu.cn

实验室主页：

https://www.chem.pku.edu.cn/wangchulab/

研究领域： 

化学生物学、蛋白质组学、计算生物学

研究兴趣：

蛋白质是生命功能的主要执行者。在复杂生命体系内系统地发现蛋白质功能位点、精准地探测和调控蛋白质功能变化，具有重要的科学意义，是化学与生命科学交叉研究的核心方向之一。王初课题组致力于综合运用化学生物学、蛋白质谱和理论计算等交叉研究手段，发展和建立了一系列“化学和计算驱动的功能蛋白质组学”新方法，在复杂生命体系内系统生物活性分子在细胞内的分子靶标和修饰位点，探究其生物学功能和作用机制，为精准探测和调控蛋白质功能提供了有力的工具。