🔹摘要 🔹

L-精氨酸（Arg）是一种条件性必需氨基酸，在人体中具有重要的生理作用[1, 2]。Arg的主要来源包括蛋白质降解、膳食摄入和从头合成[3]。Arg的合成涉及两种关键酶：精氨琥珀酸合成酶（ASS），它将L-瓜氨酸（Cit）转化为精氨琥珀酸；以及精氨琥珀酸裂解酶（ASL），它将精氨琥珀酸裂解为Arg[4, 5]。Arg在一氧化氮合酶（NOS）的催化下生成Cit和一氧化氮（NO），Arg是NO的唯一直接前体[6-9]。Arg还参与尿素循环，在精氨酸酶（ARGs）的作用下被水解为尿素和L-鸟氨酸（Orn）[10, 11]，这对于氨的解毒至关重要[12]。精氨酸：甘氨酸脒基转移酶（AGAT）是一种线粒体酶，它催化Arg生成胍基乙酸，这是肌酸合成的直接前体[13-15]。Arg代谢紊乱与多种疾病相关[5, 16]。精氨酸酶1（ARG1）缺乏会导致高精氨酸血症，这是一种以进行性神经系统症状为特征的罕见遗传性代谢疾病[17]。Arg还与多种疾病的治疗相关，例如勃起功能障碍[18, 19]、高血压[20]和心力衰竭[21]。

癌细胞的生存和生长需要氨基酸[22-24]，其中Arg是肿瘤微环境中的重要组成部分[25-27]。某些类型的癌症，如乳腺癌[28]、黑色素瘤[29]、肝细胞癌[30]、急性淋巴细胞白血病（ALL）[31]和急性髓系白血病（AML）[32]，其ASS表达缺失。这些类型的癌细胞依赖摄取细胞外Arg以维持生存，因此限制Arg供应已被探索为癌症治疗中的一种潜在辅助治疗策略[27, 33]。在培养基中去除Arg或添加ADI-PEG20（聚乙二醇化精氨酸脱亚氨酶）可导致ASS1缺陷型癌细胞在体外被清除[28, 34]。系统性给予ADI或精氨酸酶以限制Arg可用性，已在肿瘤治疗的II期临床试验中进行了研究[35]。这些研究表明，ASS1缺陷是AML患者对ADI-PEG20单药治疗产生反应的必要条件，但并非充分条件。Arg的测量是确定患者是否适合接受ADI-PEG20治疗AML的重要指标。

传统的Arg测量方法包括样品的微透析[36, 37]和化学分析[38]，这些方法无法研究细胞内分布的变化，也无法以必要的空间和时间分辨率分析Arg。荧光探针提供了非侵入性实时测量浓度及其时空变化的可能性。现有的基因编码Arg荧光探针基于Förster共振能量转移（FRET），其动态范围相对较小[39-41]。这些探针在体外报道的最大动态范围仅为约0.6[40]。更大的问题在于其特异性：这些探针不仅对Arg有响应，还对其他氨基酸（如Orn、L-赖氨酸（Lys）、L-谷氨酰胺（Gln）和L-组氨酸（His））有响应[39-41]。此外，这些探针对Arg的解离常数（K_d）（9.4或14μM）[39, 40]不适合检测生理水平的Arg，因为血浆[42]和细胞质[43]中的Arg浓度通常约为100µM。

因此，需要开发具有大动态范围和合适K_d的基因编码Arg特异性荧光探针，以用于生理和病理条件下Arg的检测。

🔹结果 🔹

Arg探针的设计、优化及体外表征

我们基于大肠杆菌（E. coli）的artJ（一种周质结合蛋白，PBP）设计了一种基因编码的荧光Arg探针。artJ在结合Arg时会发生构象变化[44-46]。与其他探针的设计类似[47-50]，我们将来自GRAB_DA2m的环状置换绿色荧光蛋白（cpEGFP）[51]整合到artJ中（图1A、B）。根据artJ和argT（一种Arg、Lys和Orn结合蛋白）的晶体结构，其叶II的环区和铰链区在底物结合时会发生显著构象变化[45, 46, 52-56]，这为cpEGFP的插入提供了潜在的位点。首先，我们在纯化蛋白上筛选了cpEGFP的插入位点（图1C）。artJ与cpEGFP之间的连接肽设计为柔性（Gly-Gly）或刚性（Pro-Pro）。基于初步筛选结果，我们选择了动态范围大于0.1的探针（图1D）。考虑到基于蛋白纯化的筛选方法耗时较长，且在体外响应的探针在细胞环境中可能表现不同，我们转而使用HEK293T细胞进行筛选。通过将探针与iSeroSnFR的膜靶向序列融合[57]，我们将探针靶向到人胚胎肾293T（HEK293T）细胞的细胞膜上，以优化连接肽的长度和氨基酸组成，从而最小化细胞内Arg对探针响应的影响。我们发现，在HEK293T细胞膜上表现出良好响应的探针的响应值分别为0.4和0.6，分别命名为ArgS0.1和ArgS0.2（图1C、D，图S1C）。随后，我们优化了连接肽邻近位点，发现响应最佳的探针的响应值为0.9，命名为ArgS1（图1D，图S1C）。总结而言，通过对1200多种不同变体的筛选，我们最终确定了三种探针，分别命名为ArgS0.1、ArgS0.2和ArgS1（图1D）。

我们将这三种探针分别在大肠杆菌中表达并纯化，随后测试了它们对各种氨基酸的特异性。结果显示，所有三种ArgS探针均特异性地响应L-Arg，而对其他氨基酸的L型或D型均无响应（图1E，图S2A、B）。这三种ArgS探针均表现出比率特性，具有两个激发峰（分别位于400纳米（nm）和500 nm附近）和一个发射峰（位于515 nm附近）。当与1 mM Arg结合时，三种探针的400nm激发峰降低，而500nm激发峰增加（图1F，图S2C、D）。我们还测量了ArgS0.1、ArgS0.2和ArgS1的Arg结合亲和力，其K_d值分别为73μM、367μM和1141μM，荧光峰值变化（ΔR/R₀）分别为1.9、4.6和19（图1G，图S2E、F）。同时，我们评估了ArgS探针对精氨酸相关代谢物的特异性。ArgS0.1对胍丁胺、Cit和精氨琥珀酸表现出可检测的响应，而ArgS0.2和ArgS1仅对Cit和精氨琥珀酸有响应（图S3A、D、G）。在瓜氨酸（Cit）结合实验中，ArgS0.1、ArgS0.2和ArgS1的K_d分别为312 μM、1162 μM和2912 μM，其荧光峰值变化约为Arg的一半（图S3B、E、H）。对于精氨琥珀酸的结合，所有探针的Kd值均超过300 μM（图S3C、F、G）。为了减少Arg相关代谢物的潜在干扰，我们通过LC-MS定量分析了HEK293T和MDA-MB-231细胞中这些代谢物的细胞内浓度。在两种细胞系中，Cit和精氨琥珀酸的浓度均低于5 μM（HEK293T细胞中Cit为1.290 μM，MDA-MB-231细胞中Cit为3.920 μM；HEK293T细胞中精氨琥珀酸为1.556 μM，MDA-MB-231细胞中精氨琥珀酸为4.156 μM），均低于ArgS探针的检测阈值（图S3J）。因此，在检测HEK293T或MDA-MB-231细胞中的Arg水平时，Cit或精氨琥珀酸的潜在干扰可忽略不计。此外，基于嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）artJ的晶体结构[45]，我们开发了三种ArgS1探针的突变版本。其中，双点突变版本ArgS1-F51L E114L对Arg几乎无响应（图S4C）。因此，该版本探针ArgS1-F51L E114L被命名为ArgS1-C，并作为后续实验的对照。为了研究pH依赖性，我们在pH 4至9的范围内测试了ArgS1和ArgS1-C。ArgS1在pH 7至8之间对Arg的响应最佳（图S4A），而ArgS1和ArgS1-C的apo形式在整个测试范围内表现出相似的pH依赖性行为（图S4B）。

Arg探针在HEK293T细胞质及亚细胞器中检测Arg变化

为了研究Arg探针是否能够在哺乳动物细胞中检测Arg，我们在HEK293T细胞的细胞质中表达了ArgS0.1、ArgS0.2和ArgS1（图2A）。Arg转运蛋白SLC7A1[58]和SLC7A2[59]在HEK293T细胞中高表达（图S5A）。当细胞外Arg浓度升高至1 mM时，我们立即观察到ArgS1、ArgS0.1和ArgS0.2在405 nm处的荧光强度下降，而在488 nm处的荧光强度增加（图2B，图S6A）。这表明所有三种探针（ArgS1、ArgS0.1和ArgS0.2）均对Arg的增加作出了响应，其最大动态范围分别为3.3、0.3和1.1（图2D，图S6D、E）。当Arg探针达到其峰值动态范围后，我们将灌注液切换回磷酸盐缓冲液（PBS），观察到三种探针在405 nm处的荧光强度立即增加，而在488 nm处的荧光强度下降，其响应恢复到基线值（图2C，图S6B、C）。

为了在HEK293T细胞质中进行原位滴定以测量ArgS1的Arg结合亲和力，我们用毛地黄皂苷（digitonin）透化细胞膜，并向细胞中添加不同浓度（1至∼60000 μM）的Arg（图S5B）。通过绘制表达ArgS1的细胞平均响应与Arg浓度的关系，获得了原位校准曲线。因此，我们测量了ArgS1在HEK293T细胞质中的Arg结合亲和力，其K_d值为64 μM（图2E）。此外，为了最小化非特异性荧光信号变化，我们在HEK293T细胞中表达了非结合对照探针ArgS1-C。如图S5D所示，ArgS1-C对1 mM Arg灌注无响应。

为了确定Arg探针是否能够检测由药物干预引起的HEK293T细胞中Arg的变化，我们在这些细胞中表达了ArgS1。我们利用精氨酸酶I和II抑制剂（Arginase Inhibitor 1, AI1）[60]和一氧化氮合酶（NOS）抑制剂L-NMMA[61-65]来调控Arg水平。如图2F所示，使用ArgS1检测到AI1或AI1与L-NMMA联合应用引起的细胞内Arg水平升高；然而，单独使用L-NMMA并未诱导类似的响应。这些结果表明，在HEK293T细胞中，精氨酸酶途径在Arg降解中的作用比NOS途径更为重要。这一结论与我们的转录组测序结果一致。在HEK293T细胞内，ARG2的表达水平最高，而ARG1和NOS2的表达水平非常低，NOS1则未表达（图S5C）。因此，ArgS1探针有效地监测了HEK293T细胞中药理干预引起的Arg浓度变化。

为了进一步研究Arg探针是否能够响应亚细胞器中的Arg，我们将ArgS1（图3）和ArgS0.1（图S7）靶向到不同的细胞器。我们将ArgS1和ArgS0.1分别与AKAP1的N端30个氨基酸引导序列[66]、p450的内质网（ER）靶向基序[67]、LAMP1衍生的序列[68]或核定位信号[69]融合，以定位到线粒体胞质侧（Mito-ArgS1和Mito-ArgS0.1）、ER胞质侧（ER-ArgS1和ER-ArgS0.1）、溶酶体（Lyso-ArgS1和Lyso-ArgS0.1）或细胞核（Nuc-ArgS1和Nuc-ArgS0.1）（图3A）。为了评估ArgS1在线粒体、ER、溶酶体和细胞核中的定位，我们分别使用Mito-Tracker、ER-Tracker、Lyso-Tracker和NucRed作为对照。结果显示，ArgS探针与相应的细胞器标记物高度共定位（图3B，图S7A）。当向培养HEK293T细胞的培养基中灌注1 mM Arg时，定位在细胞器中的ArgS探针也对Arg水平的变化作出了响应（图3C-F，图S7B-E）。Mito-ArgS1、ER-ArgS1、Lyso-ArgS1和Nuc-ArgS1探针的最大动态范围分别为3.7、3.8、3.2和3.8（图3G-J），而Mito-ArgS0.1、ER-ArgS0.1、Lyso-ArgS0.1和Nuc-ArgS0.1探针的最大动态范围分别为0.5、0.5、0.4和0.6（图S7F-I）。这些结果表明，ArgS探针在线粒体、ER和溶酶体附近区域以及细胞核内的响应相似。因此，我们成功开发了能够监测哺乳动物细胞质和亚细胞器中Arg的ArgS探针。

细胞外Arg剥夺导致癌细胞细胞内Arg水平下降

Arg饥饿正被探索为一种针对ASS1缺陷型癌症的潜在治疗策略[28, 70]（图4A）。据报道，乳腺癌细胞系MDA-MB-231不表达ASS1[28]（图4B）。我们首先验证了Arg剥夺对细胞活力的影响。Arg剥夺24小时后，MDA-MB-231细胞的活力下降（图4C），这与之前的报道一致[28]。此外，过表达ASS1能够回补MDA-MB-231细胞对Arg饥饿的敏感性（图4B、C）。为了观察细胞内Arg水平，我们开发了在MDA-MB-231细胞中稳定表达ArgS1的细胞系（图4A）。我们发现，Arg剥夺后，ArgS1探针的488/405比率及其衰减速率均显著下降，表明MDA-MB-231细胞内的Arg水平显著低于对照组（图4D、E，图S8B）。此外，Arg剥夺后，ASS1过表达组的488/405比率高于ASS1缺陷组，表明通过ASS1过表达回补了Arg水平（图4D、E）。此外，为了进一步减少非特异性荧光信号变化，我们在MDA-MB-231细胞中表达了ArgS1-C。如图S8A所示，ArgS1-C对1 mM Arg灌注也无响应。因此，ArgS1探针可用于监测癌细胞中的Arg水平。

🔹讨论 🔹

为了将ArgS探针与其他Arg探针进行比较，我们整理了各种Arg探针的特性，如表S1所示。例如，基于glnH的QBP/Citrine/ECFP探针对Arg的Kd为2.1 mM，动态范围为0.3[39]。此外，基于argT的FLIP-cpargT194探针对Arg的Kd为48 μM，动态范围为0.5[40]。然而，这些探针并非对Arg完全特异：QBP/Citrine/ECFP还对Orn有响应，而FLIP-cpargT194对Orn和Lys均有响应[39, 40]。相比之下，FLIP-cpartJ185和FLIPR探针对Arg具有特异性，其K_d值分别为9.4 μM和14 μM，动态范围分别为0.5和0.3[40, 41]。由于这些探针对Arg的响应和特异性有限，它们并不适合检测哺乳动物细胞内Arg浓度的变化。相比之下，ArgS探针——ArgS0.1、ArgS0.2和ArgS1的Kd值分别为73 μM、367 μM和1141 μM，荧光峰值变化（ΔR/R₀）分别为1.9、4.6和19。这些响应优于以往的Arg探针，且ArgS探针特异性地响应Arg，而不会与其他氨基酸发生交叉反应。最近，研究人员报道了一种名为STAR的基因编码探针，它特异性地响应Arg，并能够在体外和体内监测Arg动态[71]。与STAR相比，ArgS1的荧光响应略大（ΔR/R₀：19 vs. ~16，体外）。然而，与ArgS1不同，STAR不具备比率特性，因此需要额外的对照来校正探针表达水平的变化。

为了增强ArgS探针的最大响应，我们筛选了不同长度和组成的连接肽。结果表明，N端连接肽为2或3个氨基酸、C端连接肽为2个氨基酸时，响应更大，且N端连接肽的首个氨基酸优选为Gly。此外，在筛选过程的第4步中，测试了N端连接肽邻近的氨基酸残基。例如，将该残基替换为Ile显著提高了响应，从而开发出了ArgS1。尽管我们筛选了1200多个候选变体，但通过进一步扩展筛选范围以包括更多邻近连接肽位点，仍有可能实现进一步改进。

具体而言，HEK293T细胞质中的ArgS1的K_d值为64 μM，高于体外测量的值。类似地，iGluSnFR探针在HEK293T细胞或培养的海马神经元中的亲和力也高于体外观察到的值[47, 49, 72]。这种差异可能是由于蛋白质在不同环境和检测系统中的暴露差异，也可能是细胞环境中的辅助因子增强了Arg结合的结果。然而，即使在体外实验中加入细胞裂解液后，测得的K_d仍处于毫摩尔范围，这表明需要进一步研究。因此，为了准确量化不同环境中的Arg水平，应在多种实验条件下测量K_d以考虑这些因素。此外，ArgS1对Cit和精氨琥珀酸表现出可检测的响应。在测量不同生物环境中的Arg水平时，必须确保Cit和精氨琥珀酸的浓度低于ArgS1探针的检测阈值。

关于ArgS探针在不同亚细胞位置的动态特性，Nuc-ArgS1和ER-ArgS1的Arg灌注时间比其他位置短，这可能反映了亚细胞间Arg代谢的差异（图3C-F）。此外，我们尝试确定每个亚细胞位置的基线Arg浓度；然而，我们不确定灌注前的初始比率是否准确反映了基线浓度，因为探针游离形式的荧光比率可能在不同亚细胞区室中有所不同。此外，在每个亚细胞位置除去Arg以获得ArgS探针的游离形式具有挑战性。因此，我们选择在获得更可靠的方法来获取这些区室中ArgS探针的游离形式之前，不对亚细胞位置的Arg浓度进行量化。

Arg在生理和病理过程中发挥着关键作用；然而，其许多功能仍未得到充分理解。例如，星形胶质细胞和神经元之间Arg转运的机制尚不清楚，其作为信号分子的作用也未明确定义。此外，Arg浓度的变化可以与其他分子（如Ca²⁺、cAMP和Glu）一起使用互补的荧光探针进行监测。我们希望ArgS探针能够有助于阐明Arg代谢的机制，并为其生理和病理作用提供更深入的见解。

🔹结论 🔹

总之，ArgS1能够实时检测多种哺乳动物细胞中Arg水平的变化，为基础研究和临床应用提供了宝贵的工具。这是首个能够动态监测哺乳动物细胞内Arg浓度变化的基因编码荧光探针。此外，ArgS1在亚细胞器中对Arg表现出动态响应，并已成功用于监测MDA-MB-231乳腺癌细胞中的Arg水平。

🔹 致谢 🔹

我们感谢李毓龙教授提供GRAB_DA2m质粒。我们感谢国家蛋白质科学基础设施——北京基地北京大学分设施在Operetta高内涵成像实验提供的帮助。我们感谢北京脑科学与类脑研究所生物质谱中心于晓倩老师在LC-MS实验提供的帮助。

图2 ArgS1探针在HEK293T细胞质中对Arg浓度变化的响应

A ArgS探针在HEK293T细胞质中成像的示意图。在HEK293T细胞的细胞质中，C端融合IRES-mCherry序列的ArgS探针被转染，随后在不同溶剂灌注条件下使用共聚焦显微镜进行成像。

B 代表性图像显示ArgS1探针在HEK293T细胞质中对PBS或1 mM Arg变化在不同时间点（0分钟、10分钟、30分钟和50分钟）的响应。ArgS1探针的荧光在两个通道中可见：ArgS1 Ex488（激发波长488 nm）显示为绿色，而ArgS1 Ex405（激发波长405 nm）显示为蓝色。此外，通过IRES序列融合到ArgS探针C端的mCherry在mCherry通道中以红色显示。ArgS1探针的Ex488/Ex405比率变化进一步在ΔR/R₀通道中可视化。比例尺：10 μm。

C ArgS1在PBS或1 mM Arg中荧光响应的平均轨迹。我们在0分钟时将1 mM Arg灌注到表达ArgS1探针的HEK293T细胞中，并在35分钟时切换为PBS缓冲液。ArgS1探针在405 nm激发波长下的ΔF/F₀以蓝色表示，而在488 nm波长下的ΔF/F₀以绿色表示。mCherry的ΔF/F0以红色表示。紫色表示ΔR/R₀（右侧Y轴）。每组n = 20个细胞；数据以均值±标准误（SEM）表示。

D ArgS1探针对Arg灌注的最大响应。每组n = 20个细胞；数据以均值±标准误（SEM）表示。

E ArgS1探针在HEK293T细胞质中的剂量依赖曲线及相应的Kd值。每组n = 600个细胞（来自6个孔）；数据以均值±标准误（SEM）表示。

F HEK293T细胞中Arg浓度的药理学改变。ArgS1探针的488/405比率在分别与500 μM抑制剂孵育12、24、36和48小时前后的变化。对照组以黑色等边三角形表示，单独L-NMMA组以灰色菱形表示，单独AI1组以灰色圆形表示，L-NMMA和AI1联合组以深灰色方形表示。每组n = 600个细胞（来自6个孔）；数据以均值±标准误（SEM）表示。

图3 ArgS1探针在HEK293T细胞器中对1 mM Arg灌注的响应

A ArgS1探针在不同细胞器中表达的示意图：线粒体、内质网（ER）、溶酶体和细胞核。

B ArgS1探针定位在不同细胞区室的图像：线粒体外膜的胞质侧（Mito-ArgS1）、ER膜的胞质侧（ER-ArgS1）、溶酶体膜的胞质侧（Lyso-ArgS1）以及细胞核内（Nuc-ArgS1）。ArgS1探针的荧光在ArgS1通道中以绿色表示。细胞器特异性标记物，包括线粒体的Mito-Tracker、ER的ER-Tracker、溶酶体的Lyso-Tracker和细胞核的NucRed，在细胞器标记通道中以红色表示。ArgS1探针荧光与细胞器标记荧光的合并图像显示在Merge通道中。ArgS1探针对Arg灌注的响应在ΔR/R0通道中表示。比例尺：5 μm。

C-F 定位在不同细胞区室的ArgS1在PBS或1 mM Arg中荧光响应的平均轨迹。我们在0分钟时将1 mM Arg灌注到表达Mito-ArgS1、ER-ArgS1、Lyso-ArgS1和Nuc-ArgS1探针的HEK293T细胞中，并在达到最大响应后分别切换为PBS缓冲液。ArgS1探针在405 nm激发波长下的ΔF/F₀以蓝色表示，而在488 nm波长下的ΔF/F₀以绿色表示。ΔR/R₀以紫色表示。每组n = 20个细胞；数据以均值±标准误（SEM）表示。

G-J Mito-ArgS1、ER-ArgS1、Lyso-ArgS1和Nuc-ArgS1对1 mM Arg灌注的最大响应。每组n = 20个细胞；数据以均值±标准误（SEM）表示。

图4 MDA-MB-231细胞中Arg的成像

A ArgS1探针在MDA-MB-231细胞中表达的示意图，包括有和无Arg饥饿条件下的情况。

B MDA-MB-231细胞和ASS1过表达的MDA-MB-231细胞中ASS1的表达水平。

C MDA-MB-231细胞（圆形）和ASS1过表达细胞（方形）在Arg饥饿（深红色）或完全DMEM对照组（黑色）处理24小时后的细胞活力。Arg饥饿组的细胞活力均归一化为完全DMEM对照组。每组n = 600个细胞（来自6个孔）；数据以均值±标准误（SEM）表示。

D ArgS1探针在MDA-MB-231细胞和ASS1过表达的MDA-MB-231细胞中的荧光强度和响应变化在Arg饥饿30分钟前后成像。比例尺：10 μm。

E ArgS1探针在MDA-MB-231细胞和ASS1过表达的MDA-MB-231细胞中的488/405比率变化在Arg饥饿2小时前和24小时后每15分钟成像一次。每组n = 600个细胞（来自6个孔）；数据以均值±标准误（SEM）表示。