2024年10月4日，北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）、北大-清华生命科学联合中心（CLS）邓伍兰课题组在Nature Structural & Molecular Biology发表了题为Mesoscale chromatin confinement facilitates target search of pioneer transcription factors in live cells的研究论文。该研究对先锋转录因子（Pioneer Transcription Factors, PTFs）在活细胞中靶向染色质的单分子动力学进行了特征分析，揭示了一种“受限目标搜索”机制。该研究揭示了先锋转录因子如何识别和利用封闭染色质的空间结构以搜索目标结合位点，揭示了先锋转录因子在基因调控的一个关键过程。

细胞命运的转变依赖于特定的转录因子来激活新的基因表达程序。这一过程对于发育、分化和再生等生物学现象至关重要。然而，核小体的存在以及未开放的封闭染色质（closed chromatin）的压缩严重阻碍了大多数转录因子和转录机制有效地访问DNA模板 [1]。先锋转录因子（PTFs），如FOXA1/2在核小体结合的情况下也能有效地与DNA靶标位点结合，从而促进封闭染色质的开放并引发细胞命运的变化 [2]。这种独特的功能使得PTFs在调控基因表达和细胞行为方面具有重要作用。尽管已有大量研究集中于先锋转录因子与核小体结合的结构和功能 [3]，但它们最初搜索和结合封闭染色质的精确机制，以及使先锋转录因子与其他转录因子区别开来的动力学特性仍然不清楚。

图1 利用活细胞单分子追踪技术研究先锋转录因子在细胞核内的运动情况

本研究首先利用单分子追踪技术（single-molecule tracking, SMT）对一大类代表性的先锋转录因子（OCT4, SOX2, KLF4以及FOXA家族蛋白）测定了其与染色质的结合分数以及对靶目标搜索过程中轨迹的角度分布，发现先锋转录因子具有比非先锋转录因子（例如MYC）有更高的染色质结合能力以及在平均半径200 nm左右范围内受限扩散的运动特征。

本工作进一步以FOXA家族蛋白中FOXA2作为先锋转录因子模式分子。发现FOXA2的C末端无序结构域（C-terminal domain, CTD）对FOXA2与染色质的频繁结合以及受限扩散运动有重要作用，而对稳定结合染色质后的停留时间没有影响。使用双色光激活定位显微术（Photoactivated Localization Microscopy, PALM）发现FOXA2与核小体高密度富集的封闭染色质域（chromatin domain）有明显的共定位，而且这种共定位高度依赖于可以和组蛋白相互作用的CTD。此外，当内源性敲除CTD以后对人胚胎干细胞发育为内胚层的正常基因表达调控有重要影响，也削减了FOXA2打开封闭染色质的能力。

图2 利用双色PALM超分辨成像，基因组学以及计算模拟研究先锋转录因子的受限扩散机制

利用分子扩散模拟，本工作进一步验证转录因子在染色质域内受限扩散有助于增加靶点搜索的频率和对靶目标位点的多次结合而提高搜索效率。将FOXA2的CTD与SOX2进行融合可以进一步促进融合蛋白与染色质的结合能力以及更强的受限扩散，从而显著增加在染色质上的先锋功能。

图3 先锋转录因子搜索靶目标结合位点的工作机制

综上，本工作发现了一种广泛存在于先锋转录因子的受限目标搜索机制，这种受限扩散由先锋转录因子识别封闭染色质的空间组织特征形成，可以促进先锋转录因子搜索并结合处于封闭染色质区域中被核小体包埋的的靶目标。值得注意的是，这种受限扩散不仅依赖于PTF的DNA结合结构域，还依赖于其无序区域特异性识别封闭染色质，体现了无序区对转录因子功能的重要作用。