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科研进展

Cell｜邓兴旺与合作者解析植物光信号转导新机制

2024-09-26 点击：

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Cell｜邓兴旺与合作者解析植物光信号转导新机制

太阳光不仅是植物生长的能量来源，还是调节植物生长发育过程的关键信号。光敏色素是植物的红光/远红光感受器，作为植物的“眼睛”扮演重要角色。当下全球气候变化愈加频繁、耕地资源逐步缩紧，维护全球粮食安全是一严重挑战。过去近一个世纪，农作物产量的不断提高得益于越来越耐密植的作物新品种。将来作物产量进一步提高也将继续依赖于培育更耐密集种植的新品种。由于密植遮荫环境中植物的感光机理和耐密高产性状均和植物光敏色素蛋白息息相关，阐明植物光敏色素响应以及传递光信号的机制将有助于改善作物密植性能及对复杂环境的适应性，从而为粮食安全的保障做出贡献。

高等植物主要编码以光敏色素A（phyA）和光敏色素B（phyB）为代表的两类光敏色素，其中phyB是介导可逆红光响应的主要红光受体。光敏色素通过发色团PΦB在红光吸收态（Pr，基态）以及远红光吸收态（Pfr，激活态）之间进行可逆转变。拟南芥phyB被光激活后，可以直接与一类光敏色素互作因子（phytochrome-interacting factor，PIF)互作，传递光信号并调控下游基因表达，促进光形态建成。因此phyB和PIFs构成了植物响应周围光环境的关键信号模块。拟南芥中8个PIF成员（PIF1-8）均包含两个重要结构域：N端为结合phyB-Pfr的激活态结合域（Active-PHYB Binding motif，APB），其C端为结合DNA的bHLH二聚化结构域。在黑暗条件下，phyB-Pr定位于细胞质中，PIF1/3/4/5在核中作用驱动幼苗暗形态建成的发育过程（下胚轴伸长，子叶闭合）。一旦幼苗感知红光，phyB-Pfr入核进而负调控上述PIFs，抑制下胚轴伸长和促进子叶展开，并维持植物光生长形态。尽管2022年美国Vierstra团队在Nature发文揭示了phyB-Pr的结构，但phyB-Pfr及其识别PIF的结构生物学基础及其调控机理仍不清楚。

2024年9月23日，北大-清华生命科学联合中心邓兴旺课题组与北京大学现代农业研究院王继纵课题组合作在Cell发表了题为Light-induced remodeling of phytochrome B enables signal transduction by phytochrome-interacting factor的研究论文，揭示了长期以来期待的phyB光信号转导的最初反应机制。

该研究解析了模式植物拟南芥光激活态phyB-Pfr以及不依赖于光的组成型激活突变体phyB ^Y276H分别结合下游信号分子PIF6的复合物高分辨率冷冻电镜结构（分辨率依次为3.1 Å，3.2 Å）。基于分子结构分析、结合突变体蛋白光谱性质测定、体外以及半体外生化实验表征、以及转基因植物的表型分析，揭示了光激活phyB由Pr转变为Pfr的详细分子机制，并提出了phyB和PIF之间“诱导-契合”的相互作用模型，填补了植物光敏色素信号传导机制研究的一个关键空白。

由于全长PIFs蛋白存在大量无序结构，体外重组表达以及组装phyB-PIF全长蛋白复合物存在相当大的困难。考虑到系列文献报道中PIFs的APB motif（N端100个氨基酸）足以介导其与phyB在体内及体外互作，研究者选取了结合能力最强的PIF6-APB（PIF6-100，仅N端100个氨基酸）进行phyB-PIF的复合物组装并制备冷冻样品。最终成功解析得到了phyB-Pfr-PIF6以及缺失HKRD结构域（仅含N端908个氨基酸）的phyB ^Y276H-908-PIF6复合物的高分辨率冷冻电镜结构。结构分析表明phyB-Pfr在光激活之后发生大规模结构重排，其光感应模块（photosensory module, PSM）从Pr状态下“头对尾”转变为Pfr状态下“头对头”二聚体，且PIF6-APB单体结合在phyB-Pfr二聚体界面的一侧，组成phyB-PIF6三聚体。此外，phyB ^Y276H-908-PIF6复合物结构与phyB-Pfr-PIF6几乎完全一致（图1）。

图1. phyB-Pfr-PIF6（B）和phyB^Y276H-PIF6（C）均为不对称三聚体

为了阐明光激活驱动phyB的结构重排，作者细致比对了之前文献报道的phyB-Pr及本研究获得的phyB-Pfr结构，发现发色团PΦB分子在吸收红光后，其D环翻转了180˚，并且和口袋中的系列氨基酸重新建立互作网络（图2A，左），最终导致PHY结构域里与其互作的舌状突出结构发生由β片层到α螺旋的构象转变（图2A，右）。结构分析表明，丝氨酸S584对于稳定α螺旋形式的舌状结构非常重要（图2A，右），进一步的体外生化以及转基因植物表型分析证明了S584对于维系phyB-Pfr激活状态和phyB信号通路至关重要（图2B）。

图2. 光诱导PΦB分子（A，左）和PHY结构域舌状突出结构（A，右）的构象转变及功能验证（B）

在Pr状态下，phyB的C末端结构域PAS2以及HKRD与N末端结构域GAF和PHY互作以维系“头对尾”二聚体构象。而在phyB-Pfr中，其PHY结构域的舌状突出结构转变为α螺旋后，会直接和Pr状态里的PAS2结构域发生空间冲突（图3A，左；图3B，左），从而破坏Pr状态下PAS2和PHY结构域之间的广泛互作，这会进一步破坏HKRD和PHY结构域（图3A，左；图3B，中），以及HKRD和GAF结构域（图3A，右；图3B，右）之间的分子内互作，这一系列的构象变化完全打破Pr状态下的“头对尾”结构，最终激活phyB。此外，缺失HKRD结构域的phyB截短体蛋白（phyB-908，仅含N端908个氨基酸）在光激活之后倾向于单体形式存在（图3C），进一步佐证了phyB-Pr在光激活后，原来由N端和C端模块互作维系的“头对尾”二聚体被打破，进而形成phyB-Pfr。

图3. PHY 结构域舌状突出结构的构象转变驱动phyB-Pr重构形成phyB-Pfr（A，B）及生化验证（C）

光激活后的phyB-Pfr分别利用其N末端的NTE结构域以及由整体N末端结构域形成的“头对头”二聚体，来识别和结合PIF6-APB的N末端和C末端（图4A）。PIF6-APB的N末端通过形成一个β发夹结构（PIF6-APB-β）与phyB-Pfr的NTE结构域发生广泛互作（图4B），而phyB-Pfr二聚体结构中另一分子phyB并不具备稳定结构的NTE，表明NTE的稳定结构是由PIF6-APB的结合所诱导形成的。此外，PIF6-APB的C末端通过形成一个α螺旋结构（PIF6-APB-α）同时与两个phyB-Pfr的N末端结构域产生广泛互作（图4C），印证了PIF6-100促进的phyB-908-Pfr的二聚化（图3C）。作者进一步通过系列生化、光谱实验表征、结合转基因植物的表型明确了NTE结构域以及N末端结构域介导的phyB-Pfr二聚化对于phyB-PIF互作的重要性。

图4. phyB-Pfr的N末端结构域对PIF-APB的特异性识别（A）以及NTE结构域特异性识别PIF-APB的N末端β发夹结构（B），phyB-Pfr二聚体特异性识别PIF-APB的C末端α螺旋结构（C）

两个phyB-Pfr的结构比对表明phyB-PIF6复合物结构中的phyB-Pfr形成了不对称的二聚体（图5A），这些不对称性导致phyB-Pfr二聚体的另一侧界面没有足够空间与PIF6-APB-β以及PIF6-APB-α形成合适的互作（图5B）。作者进一步通过pull-down以及Co-IP assay评估了溶液状态下phyB和PIF-APB以及PIF-FL的互作模式，生化数据表明PIF3和PIF6的APB motif以及PIF1和PIF3的全长蛋白均可以和phyB-Pfr二聚体形成摩尔比为1:2（2:4）的复合物。

图5. 不对称的phyB-Pfr二聚体只能结合一个PIF6-APB单体

总的来说，这项研究揭示了“头对头”激活态phyB二聚体识别结合PIF6-APB的复合物结构，解决了光敏色素研究中光如何诱导phyB变构激活并转导PIF信号的关键问题（图6），为作物感光性状的改造以及phyB相关光控基因表达的“光遗传学”工具开发提供了分子水平的精细图纸。

图6. 红光激活phyB并转导PIF信号的结构机制模型

北京大学现代农业研究院、北大-清华生命科学联合中心 邓兴旺教授和北京大学现代农学院、北京大学现代农业研究院 王继纵 研究员为该论文的通讯作者。北大-清华生命科学联合中心博士研究生 王征东和 宋艳萍、北京大学现代农业研究院科研助理 王文凤和 赵迪迪、以及北京大学现代农业研究院 林晓莉博士为论文共同第一作者。北京大学现代农业研究院赵珺博士、迟程博士和高级工程师徐斌、中国科学院遗传与发育生物学研究所博士研究生沈萌对本研究也做出了重要贡献。冷冻样品制备、样品筛选和数据收集在研究院生物微观结构研究平台完成。该研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发项目、山东省重点研发项目、山东省科技创新基金、中科协青年人才托举工程、山东省泰山青年学者项目、北京大学现代农业研究院、潍坊现代农业山东省实验室、小麦育种全国重点实验室、北京大学蛋白质与植物基因研究国家重点实验室相关经费的资助。

原文链接：

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)01023-7

邓兴旺

北京大学现代农业研究院教授

北大-清华生命科学联合中心PI

邮箱：

deng@pku.edu.cn

研究方向：

1、植物光形态建成的调控机制

光是对于植物发育最重要也是最基本的生长信号。本课题组多年来以拟南芥为模式植物，通过遗传筛选获得了一系列光形态建成的抑制因子COP/DET/FUS。它们的突变体在暗中可以完成不同程度的光形态建成。近十年的研究结果表明这些因子在植物体内不仅可以形成三个复合体，即COP1复合体，CSN复合体 (COP9 signalosome, CSN)，CDD (COP10, DDB1 and DET1)复合体, 并以复合体的形式参与或调节泛素化途径来调控光信号传导。最近的研究表明，三个复合体的协同作用依赖于CULLIN4 E3 连接酶，以及COP1-SPA (Suppressor of phytochrome A, SPA)所组成的系列复合体。同时，研究表明光信号中的重要转录因子HY5等在全基因组水平上具有广泛的调控能力。目前在此基础上，我们将继续综合运用遗传学、生物化学、分子生物学、细胞生物学等不同的现代实验手段，进一步解析光信号的传导通路。

2、杂交优势

杂交优势是自然界普遍存在的一种复杂生物学现象，在农业生产中获得了广泛的应用。但是杂交优势的分子遗传机理迄今尚不清楚。随着分子生物学、基因组学和生物信息学研究的深入和发展，利用系统生物学手段开展杂交优势分子机理的研究，具有重要的科学意义和实际应用价值。基因型异质的亲本其杂交子一代许多性状上不同于双亲，这必然涉及到亲本基因组在杂交遗传背景中相互作用而引起基因表达调控发生变化。目前，我们利用高通量测序技术对具有不同优势的杂交组合的亲本和子一代不同组织在不同环境条件下进行全基因组基因差异表达分析，并进一步分析造成这种差异表达基于顺式作用元件和反式调控因子DNA序列多态性的遗传机制，以及基于DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和非编码RNA的表观遗传机制，全面探索杂交优势的可能分子机制。

为了更好地在农业生产实践中利用杂交优势，同时整合其它有利性状，我们需要开展全基因组选择育种。本课题组通过对多个水稻品种全基因组重测序结果的分析，提取了大量单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNP）位点，建立了高通量的SNP标记检测平台。目前我们正运用这些检测平台，对各种水稻种质资源和杂交分离群体进行分型分析，在全基因组层次建立性状与标记的关联性，进一步通过数学建模，开展分子设计育种。

3、拟南芥与水稻全基因组非编码RNA注释及功能分析

非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)是直接以RNA形式行使生物学功能的核糖核酸群体总称，它们不仅包括长度为20-27个核苷酸的小分子RNA (microRNA以及siRNA)；长度为50-300个核苷酸在细胞中作为转录或者翻译调节子的RNA；也包括甚至长达1KB以上的多数功能未知的非编码RNA。近年来，在果蝇，线虫等模式生物中，越来越多的报道不断更新这些非编码RNA的基因组注释，同时它们新功能的不断挖掘也逐渐填补人们对于转录组认识的空白。本实验室通过独特的分离方式以及深度测序技术在拟南芥和水稻全基因组对50-300核苷酸长度的ncRNA进行注释，并以此为平台结合分子生物学，生物化学及细胞生物学等手段，试图于以下几个方面探索ncRNA的功能：

1）结合反向遗传学筛选，研究小核仁RNA在拟南芥生长发育中的作用机理

2） ncRNA参与在拟南芥光形态建成调控中的分子机理

由较长ncRNA产生的小分子RNA在拟南芥及水稻发育调控中的分子机理

4. 生物信息平台的建设和应用

生物信息学是在生命科学的研究中，利用信息技术对大量而复杂的生物数据进行存储、检索和分析，进而揭示生物学奥秘的新兴学科。近年来，随着基因组序列的不断完善和各种大通量采集数据实验方法的开发，生物信息学也在生物研究中起到越来越重要的作用。本课题组通过长期基因组水平转录组及表观遗传组的研究，建立起较完善的生物信息平台。具体通过设计合理的高通量实验、开发大规模数据快速处理的软件、对实验数据进行可靠处理流程、提供可视化方案、利用各种信息学统计学方法发掘海量数据的生物学意义这一系列步骤，对植物体内各种机理研究和生物技术的应用都有重要作用。本生物信息平台的特点：（1）即独立运行进行生物信息学方法研究又与本实验室生物学研究问题紧密结合如植物光调控中的转录组及表观遗传组分析、植物杂种优势基因组水平分析、全基因组水平分子设计育种等等；（2）本课题组对感兴趣的生物学问题，通过合理的实验设计，获得大量第一手数据，利用生物信息学直接参与和指导生物课题的研究。