近年来，共价配体因其独特的作用机制与选择性修饰能力，在生命科学和临床医学研究中得到广泛应用。以索托拉西布（Sotorasib） 为代表的共价药物在临床上的成功，充分证明了这类分子在攻克传统“不可成药”靶点方面的巨大潜力。然而，如何高效开发兼具高亲和力与高选择性的共价配体，仍是该领域面临的一项重要挑战。

传统的共价配体开发策略通常采用 “多配体”对“单靶标” 的靶点导向性筛选模式，能够系统比较不同配体对特定靶标的结合效能。然而，此类策略受限于预设的单一靶标体系，难以系统性发掘新的作用靶点。基于活性的蛋白质分析（Activity-based protein profiling, ABPP）技术则可在蛋白质组水平表征共价配体的结合靶点，深度挖掘其结合潜力以开发新靶点。但值得注意的是，现有的基于竞争性ABPP的筛选方法受限于其竞争性标记模式，只能采用 “单配体”对“多靶标” 的模式对单一配体进行表征，无法实现对不同配体的“头对头”比较。

针对上述局限，作者希望发展新一代化学蛋白质组学分析平台，实现蛋白质组尺度下的“多配体 vs 多蛋白”并行、直接与定量筛选。将药物发现从“一对一擂台赛”或“车轮战”，升级为一场“蛋白质组世界杯”，让众多候选分子相互直接竞争，层层淘汰，最终决出针对特定靶点的最强“冠军分子”。为实现这一设想，作者对传统ABPP技术进行优化，开发出GC-ABPP筛选平台，利用多种完全功能化探针的竞争性标记，快速绘制蛋白质组学尺度的探针-靶标亲和力矩阵，比较不同探针的靶标亲和力。

首先，作者使用完全功能化探针（FFP）替代传统的亲电片段，利用探针修饰肽的质量位移差异实现不同探针修饰靶点的区分，为多探针同时表征提供了可能；随后，作者通过引入还原二甲基化定量策略，对比“对照组”（每个探针单独以高浓度标记一份蛋白质组，然后混合）和 “竞争组”（五个探针以等摩尔浓度混合，共同标记一份蛋白质组）中同一探针的标记水平差异，实现精确定量每个探针-半胱氨酸对的 “竞争水平”；最后，为了平衡筛选通量与位点覆盖度，并排除组间探针差异带来的假阳性信号，作者将完全功能化库划分为多个亚组分别进行第一轮筛选绘制探针-靶标亲和力矩阵。并且将每组中针对特定靶蛋白的“优胜者”探针挑选出来重新编组，进行第二轮、第三轮的迭代筛选，最终筛选出对整个分子库而言亲和力最高的 “冠军”配体（图1）。

为验证GC-ABPP筛选的可靠性，作者首先选取了25个探针进行概念验证，通过两轮筛选得到了靶向MGMT活性位点Cys145的高亲和探针 P9。基于可溶性质谱标签的修饰率鉴定策略表征表明，P9对MGMT Cys145也表现出了最高的修饰率，证明了GC-ABPP筛选结果的可信性（图2）。

图 2: GC-ABPP可靠性验证

随后，作者基于片段组合策略与固相萃取技术，快速构建了包含65个完全功能化探针的探针库（图3）。通过GC-ABPP技术对探针库进行系统性筛选，研究团队成功绘制了覆盖超过6000个半胱氨酸位点的探针-靶标亲和力矩阵，UGDH、BCAT2、CASP9等关键蛋白上的功能性半胱氨酸均被覆盖到。值得注意的是，本轮筛选为1421个半胱氨酸位点（对应1033个蛋白质靶标）匹配到了高亲和力共价配体。这些蛋白中的70%在DrugBank数据库中尚无已知配体记录，且功能多样，涵盖多个疾病相关通路，为开发全新药物调控靶点提供了宝贵线索（图4）。

图 3: 完全功能化探针库的构建。

图 4: 基于GC-ABPP的第一轮筛选结果分析。

在后续工作中，作者进一步聚焦于BCAT2的Cys342位点与UGDH的Cys276位点，利用GC-ABPP的迭代筛选能力，成功鉴定出了分别针对这两个靶点的高亲和力探针P64与P19，并通过实验验证了上述探针的靶蛋白结合能力与功能抑制活性（图5，图6）。

图 5: 靶向BCAT2的高亲和共价配体发现。

图 6: 靶向UGDH的高亲和共价配体发现。

综上所述，本文开发了基于多探针竞争策略的蛋白质组共价配体筛选技术（GC-ABPP）。作者在isoTOP-ABPP基础上，构建了可实现 “多探针”对“多蛋白” 直接比较的筛选平台，能够在蛋白质组水平上高效评估探针对靶点蛋白的标记能力。基于该平台，作者对构建的完全功能化探针库进行了大规模表征，覆盖超过6000个半胱氨酸位点，并成功鉴定出靶向BCAT2与UGDH蛋白的高亲和力共价配体。随着完全功能化探针化学空间的不断拓展与自动化平台的集成，GC-ABPP技术有望为共价药物发现，尤其是针对“不可成药”靶点的药物研发，提供一个更为高效、系统的筛选平台。