乙酰胆碱（Acetylcholine, ACh）是人类发现的第一种神经递质，在中枢神经系统与外周神经系统中均扮演关键角色。它广泛参与注意力调控、运动控制、学习记忆、睡眠–觉醒周期，并与动机、奖赏、决策和情绪等核心行为密切相关。近年来，绿色荧光的ACh探针（如GRABACh2.0、GRABACh3.0 和iAChSnFR）已被报道并广泛应用，让研究者得以实时“看见”ACh的动态变化。然而，越来越多的证据表明，ACh作为大脑神经调控网络的重要成员，在发挥作用时往往伴随多巴胺（DA）、五羟色胺（5-HT）等其他神经递质的协同释放与交互调控。要精准解析ACh与其他神经化学分子之间的调控动态和相互关系，亟需多色探针以实现多种神经化学信号的同步检测。遗憾的是，现有ACh探针均基于绿色荧光蛋白开发，而目前广泛使用的DA、5-HT、去甲肾上腺素（NE）及钙离子探针，也大多位于绿色光谱区间。这意味着，长期以来，研究者难以在同一动物、同一脑区、同一时间点，同步记录ACh与其他神经化学分子的动态变化，极大限制了对“多递质协同调控行为”这一关键科学问题的探索。

2026年6月16日，北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心李毓龙教授团队联合首都医科大学附属北京朝阳医院魏昌伟教授团队，在《Nature Neuroscience》在线发表题为《Red-shifted GRAB acetylcholine sensors for multiplex imaging in vivo》的研究论文。研究团队成功开发首个高性能红色ACh荧光探针，实现了ACh与DA、5-HT及NE等多种信号在多个空间尺度下的同步双通道活体记录与成像，为解析脑内多种神经调质系统之间的协同作用提供了重要研究工具。

李毓龙团队基于自主研发的 GRAB（GPCR-Activation Based Sensor）探针策略，巧妙地将人源和鼠源M型ACh受体（M3R）融合成嵌合体骨架，并在其第三胞内环（ICL3）中插入循环重排的红色荧光蛋白（cpmApple）。经过对插入位点、受体骨架与荧光模块的突变筛选与系统优化，成功构建出高亲和力的红色ACh探针，命名为rACh1h。在光学特性方面，rACh1h探针单光子激发峰值为 565 nm，双光子激发峰值为 1050 nm 与常用的绿色探针有很好的光谱区分度。体外细胞培养体系中，rACh1h探针展现出良好的膜定位效率，对100 μM ACh的响应是gACh3.0探针的5倍，表观亲和力为400 nM。rACh1h的荧光信噪比和亲和力均超过了现有的绿色ACh探针，为活体水平上同时观测多种神经递质的动态变化，提供了高性能的检测工具。

rACh1h探针的开发

为检验rACh1h能否报告活体动物中内源ACh的释放，研究团队结合光遗传学技术，在小鼠脑内成功记录到内源性ACh的释放动态，并利用药理学手段进一步验证了信号的特异性。得益于探针优异的性能，研究人员不仅能够检测诱发的ACh释放，还能够灵敏且稳定报告小鼠自由活动状态下产生的自发胆碱能活动。

rACh1h检测内源ACh的释放动态

rACh1h探针最重要的突破在于实现了ACh与其他神经递质的同步观测。研究团队将红色rACh1h与绿色多巴胺探针gDA3h共同表达于小鼠BLA脑区，在奖赏学习过程中同步记录ACh和DA的释放动态。实验结果显示，两种神经递质均随着学习进程发生了改变，从最初主要响应实际糖水奖励，逐渐转变为对编码奖励的声音产生反应。研究团队进一步将rACh1h与g5-HT3.0探针联合应用于睡眠-觉醒实验，实现了对ACh和5-HT的长时程同步记录。结果发现，两种神经递质在清醒状态和非快速眼动睡眠阶段呈现相似变化趋势，而在快速眼动睡眠阶段则出现相反的变化趋势：ACh水平升高，而5-HT水平下降。这一发现揭示了不同神经调质系统在睡眠状态转换过程中可能承担不同功能，也展示了双色记录技术在大脑复杂状态研究中的独特优势。

rACh1h 在光纤记录系统中实现与其他神经递质的同步观测

rACh1h 在光纤实验中已展现出高灵敏度、高时间分辨率和良好的双色兼容性，在成像系统中应用时，其更进一步展现了对 ACh 动态变化的高时空分辨检测的能力。将rACh1h和NE2m探针共同表达在小鼠背部皮层，结合大视场成像显微镜，可以实现背部皮层多个脑区的ACh和NE释放动态的实时监测。在声音刺激的范式中，给小鼠分别播放野猫叫声、小鼠交配或小鼠刺痛时叫声的录音，rACh1h和NE2m在皮层各个脑区展现出不同的区域分布和动态变化特征。可靠报告了小鼠大脑皮层在处理声音信息时，ACh和NE两种神经递质的释放动态。

rACh1h与绿色NE2m探针共同成像揭示皮层神经递质的动态变化

综上所述，李毓龙实验室拓宽了ACh探针的光谱，成功开发出首个红色ACh探针，能够实现高灵敏度、高特异性、高时空分辨的活体ACh动态检测。红色ACh探针能够与其他绿色探针联合使用，同时报告两种神经化学分子的动态变化，助力实验者解析复杂行为背后多种神经递质相互调控的神经机制。

北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心李毓龙教授，首都医科大学附属北京朝阳医院麻醉手术中心魏昌伟教授为共同通讯作者。北京大学生命科学学院博士后谢书，首都医科大学附属北京朝阳医院麻醉手术中心苗晓蕾博士，北京大学成都前沿交叉生物技术研究院李国川，为该论文的共同第一作者。李毓龙课题组郑宇博士，李梦尧博士，纪恩博士，李少创，蔡儒仪博士，耿岚，冯杰思博士，以及首都医科大学附属北京朝阳医院麻醉手术中心王金旭博士对文章做出了重要贡献。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、生命医学峰基金、新基石科学基金会等多项经费的资助和大力支持。

李毓龙实验室聚焦于神经元通讯的基本单元——突触，从工具开发和机制研究两个层面开展工作。一方面，开发新型成像探针等前沿研究工具，以在高时空分辨率下解析神经系统的复杂功能；另一方面，借助这些先进工具探究突触传递的调控机制，重点研究生理及病理条件下神经递质释放的调节过程。更多关于李毓龙实验室的研究工作详见：http://yulonglilab.org/。

谢书，北京大学生命科学学院博士后，博士毕业于上海科技大学/中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心，致力于新型荧光探针的在体应用。

苗晓蕾，首都医科大学附属北京朝阳医院麻醉手术中心医生，博士毕业于北京协和医学院。致力于新型荧光探针工具的在体应用。

李国川，北京大学成都前沿交叉生物技术研究院研究助理，硕士毕业于中国农业大学。致力于新型荧光探针的开发与刻画。

邮箱：

yulongli@pku.edu.cn

实验室主页：

http://www.yulonglilab.org/

研究领域：

1. 开发工具研究神经调节和神经系统连接组学

2. 神经调节的功能研究

3. 孤儿G蛋白偶联受体研究

研究兴趣：

人的大脑由数十亿的神经元组成，后者又通过数万亿的突触组成复杂的神经网络。不同种类的神经元经过或远或近的投射，通过突触与其他神经元进行信息交流，实现感知、决策和运动等高级神经功能。

研究大脑的最大挑战在于脑的高度复杂性。我们实验室集中在神经元通讯的基本结构突触上，从两个层面上开展研究：一是开发前沿的工具，即开发新型成像探针，用于在时间和空间尺度上解析神经系统的复杂功能；二是借助先进的工具探究突触传递的调节机制，特别是在生理及病理条件下对神经递质释放的调节。

具体而言，对于工具开发，我们集中于：

1，结合光遗传学和荧光成像，无损伤性的研究神经元之间的电突触连接。电突触的异常可导致耳聋、癫痫、脑部肿瘤和心脏功能异常等疾病。

2，开发可遗传编码的检测神经递质/调质的荧光探针。神经递质/调质是神经元化学突触传递的关键介导分子，与感知、学习和记忆以及情绪密切相关。

利用上述荧光探针，我们的功能性和生理性的研究集中于：

1，结合生物信息学、分析化学、生物化学、生理学和成像学方法，系统地探索和鉴定潜在的新型小分子神经递质。

2，研究神经元中重要的分泌性囊泡“高密度核心囊泡”的蛋白质组学，分析囊泡内的神经肽组成。这些神经肽对于调节食物摄取、侵犯性行为和生物节律有重要的调节作用。

3，寻找上述新型化学递质/调质小分子的对应受体，即寻找“孤儿”受体的配体。

4，结合双光子成像和可遗传编码的荧光探针，使用果蝇和小鼠作为模式生物，研究嗅觉传导或睡眠过程中脑的工作机制。