【学术笔记】被子植物配子体发生与功能研究-生命科学联合中心

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【学术笔记】被子植物配子体发生与功能研究

2023-11-02 点击：

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【学术笔记】被子植物配子体发生与功能研究

记录人：曹子宁焦雨铃实验室

2023年11月02日下午，受北大-清华生命科学联合中心焦雨铃研究员邀请，中国科学院遗传与发育生物学研究所研究员杨维才院士在吕志和B101报告厅带来了一场题为“被子植物配子体发生与功能研究”的精彩报告。

焦雨铃研究员介绍杨维才院士

杨维才院士做报告与交流

【概要】

被子植物的生殖发育过程与动物和低等植物有很大的不同，相比于动物生殖细胞通过减速分裂产生单倍体细胞再直接分化成功能配子，植物的发育是先成体细胞分化再进行生殖细胞的发育，并且单倍体孢子通过有丝分裂产生具有双配子的独特的多细胞结构。生殖发育过程是植物生活史的重要环节，在这个过程中，存在很多发育生物学最基本的问题，是研究发育生物学基本问题的理想模式系统。这次报告中，杨维才院士系统且详细的给大家分享了多年来研究组在雌配子体领域的精彩工作。首先，杨教授给我们简单讲述了他早年在国内外求学的经历，用自己的经验告诉同学们研究生阶段的训练是非常重要的。接着，杨维才教授从被子植物生殖发育特性的基础知识出发，向我们介绍了90年代之前，由于生殖发育过程的单倍体世代、母体效应和突变比较复杂等特性导致地早期开展研究的困难之处，并介绍了gene/enhancer trap技术给拟南芥中遗传学研究带来的便利。利用这个技术，杨教授在拟南芥中发现了SPOROCYTELESS(SPL)基因，该基因在雌雄配子发生过程中都发挥重要作用。之后，杨教授向我们介绍了他回国后在胚囊发育突变体的分离鉴定方面所做的工作。最后，杨教授着重的向我们介绍了课题组多年来在胚囊的中央细胞调控花粉管导向领域所做的工作，包括07年课题组首次发现了胚囊中央细胞在花粉管导向中的关键作用，之后提出了CCG/CBP1/AGLs 复合体非细胞自主性地调控花粉管吸引信号LUREs的假说，最近又发现了中央细胞参与调控双受精的补偿机制等出彩的工作。

【精彩回顾】

被子植物生殖发育的特性

杨维才院士首先向我们简单介绍了有关被子植物生殖发育的一些基础知识。与动物的减数分裂产生的单倍体孢子直接分化成功能配子不同，植物的单倍体孢子通过有丝分裂产生双配子的多细胞结构。雄配子体（花粉）是营养细胞携带两个精子的特殊结构，营养细胞为精子的生存提供保障。同样的，雌配子体（胚囊）是一个八核七细胞的结构，其中包括双配子（卵和中央细胞）和辅助细胞（助细胞和反足细胞）。被子植物的受精方式是与低等植物还有动物不同的管粉受精，花粉掉落在雌蕊的柱头上，经过识别后会长出花粉管，一直长到胚珠的株孔处，将精子传递过去。正因为双配子的结构，被子植物的受精为双受精：卵和其中一个精子形成胚胎，中央细胞和另一个精子形成胚乳。

图一，拟南芥胚珠和胚囊¹。红色：卵细胞，绿色：助细胞，蓝色：中心细胞，黄色：反足细胞，紫色：被膜。

在开花植物如拟南芥中，大孢子母细胞减数分裂产生4个大孢子，1个可以生存下来，其余3个降解。存活下来的大孢子随着发育的进行，细胞体积不断地增大，当细胞体积增大到一定程度时，进行第一次核分裂形成2个细胞核.这2个核分别移向胚囊的珠孔端和合点端，接着在两极的细胞核进行第二次核分裂，两端分裂后细胞核排列方向垂直，之后再次核分裂形成8核的结构。这个过程与普通的细胞分裂不同，8个核在同一个细胞里，没有发生细胞的分裂。接下来胚囊开始细胞化，8核胚囊的两级各有一个核体积增大并向中间移动，在移动的过程中，形成了7个细胞的结构，中间2个细胞核称为极核，之后这两个核融合形成二倍体的核，是中央细胞的核。珠孔端剩余的3个核产生的3个细胞1个是卵细胞，另外2个是助细胞。合点端的3个核形成3个反足细胞，之后被降解掉。卵细胞和助细胞的核极性不同，卵细胞的核靠近合点端，助细胞核靠近珠孔端。拟南芥这种胚囊发育类型属于单胞型，也叫廖型，除了这种发育类型还有其他的发育类型，包括双孢型和四孢型。

图二，拟南芥雌配子发育过程^2,3

生殖发育是植物生活史的重要环节，也是研究发育生物学一些基本问题的理想模式系统：体细胞是如何变成生殖细胞的？配子细胞的命运是如何确定的？雌雄细胞是如何相互识别并完成受精的？受精卵是如何发育成一个完整的个体的？同时，种子发育是农作物产量形成的前提和保障，克服种内种间生殖障碍是杂种优势利用的前提。因此，植物的生殖发育过程非常值得去研究和探索。

SPL在促进生殖向配子体世代过渡中发挥的核心作用

上个世纪90年代，转座子标记技术（gene/enhancer trap system）应用到拟南芥中⁴，给拟南芥中的遗传学研究提供了很大的便利。当时，关于调控植物繁殖这一关键步骤的基因和蛋白质的信息很少，杨维才教授他们利用enhancer trap技术试图去克隆和研究配子体发育过程中的基因。通过筛选鉴定，他们发现了一种基因，SPOROCYTELESS (SPL)。突变体spl不形成小孢子细胞，花药由高度空泡化的薄壁细胞组成,因此突变体不育。

图三，花药发育过程中的野生型WT和spl突变型表型，SPL蛋白结构域⁵

SPL基因产物是一种转录因子，在spl突变体中，雄性和雌性生殖细胞的发生都受到影响。随后，2004年美国科学院院士Elliot M. Meyerowitz研究组在Nature上发表研究论文，发现SPL是花同源基因AGAMOUS(AG)调控的靶点⁶。AG编码一种在雄蕊和心皮原基中表达的MADS-box家族转录因子，是激活SPL表达所必需的。但之后的十几年中，SPL基因调控的分子基础仍不清楚。2015年，杨教授课题组发现SPL属于一个新的转录抑制家族，该家族在陆地植物中有173个成员，特异存在于胚胎中，它们的n端都含有一个保守的基序，c端含有一个EAR基序⁷。同期秦根基教授课题组也发表了类似的工作，证明了SPL通过其c端EAR基序与TPL/TPR家族的共抑制因子相互作用，通过n端与TCP家族的转录因子相互作用，抑制孢子细胞分化的负调控因子，从而促进孢子发生8。

图四，SPL调控孢子发生的过程示意图⁹

胚囊发育突变体的分离鉴定

由于当时高等植物配子体发生过程中单倍体基因组有丝分裂周期的遗传调控机制尚不清楚，杨教授课题组也在胚囊发育的2核期到8核期过程中发现了很多新的调控基因的突变体，例如swa1/2/3，rh36，gfa1-3等。这类突变体的特点是胚囊发育停滞在2N、4N或8N时期。比如在slow walker1(swa1)中，雌配子体的发育不同步，导致在同一雌蕊内的胚囊停滞在二核、四核或八核阶段。通过进行延迟授粉，一小部分swa1胚囊能够发育成功能性的雌配子体。SWA1编码的蛋白位于间期细胞的核仁中，RNA干扰结果表明，敲除SWA1显著抑制根生长并会导致未加工的18S pre-rRNA积累，说明SWA1调控18S rRNA前体的加工10。

图五，野生型和swa1突变体雌蕊的胚珠发育示意图和RNAi的愈伤组织中18S Pre-rRNA的加工10

此外，基因SWA2参与60S核糖体前体从核仁向核基质运输，另一个基因GFA1调控RNA的加工……这些都表明，核仁功能是十分重要的，核糖体发生是胚囊发育的重要调节靶点。

胚囊中央细胞调控花粉管导向

精细胞需要通过花粉管运输才能成功受精，杨教授课题组在2007年首次发现了胚囊中央细胞在花粉管导向中的关键作用。在当时，前人的研究表明，胚囊的助细胞对花粉管的引导至关重要。杨教授他们发现了一个叫central cell guidance (ccg)的突变体，该突变体发育正常，但在花粉管引导方面存在缺陷。将该CCG基因克隆后发现其在中央细胞特异性表达，仅在中心细胞中表达CCG就足以恢复正常的花粉管引导表型，这说明中心细胞在花粉管引导中起着关键作用。该发现打破了当时人们认为只有助细胞负责吸引花粉管的观点。

图六，野生型和ccg突变体植物的花粉管引导¹¹

杨教授他们后来的工作又找到了与CCG相互作用的蛋白CCG BINDING PROTEIN1(CBP1)，它与CCG、AGLs、Pol II、mediator等形成一个转录调控复合体。

图七，CCG-CBP1在中央细胞中介导的转录起始中的功能模型12

RNA-seq分析表明，与野生型胚珠相比，ccg胚珠中有428个基因下调，其中147个基因编码小肽，这100多个小肽中，就有先前报道过的雌性吸引花粉管的信号LUREs。研究者们继续检测了5个LURE1基因在ccg突变体中的表达，不同于野生型中5个LURE1基因都非常特异的在助细胞表达，在ccg突变体中LURE1s表达量大大降低，说明CCG可以调控花粉管吸引信号LUREs的表达。

图八，ccg中下调基因的分布与分类¹²

图九，LURE1和助细胞表达的CRPs在ccg中下调¹²

但在当时还无法解释一个问题，即agl80突变体的中央细胞不能成熟，但吸引花粉管的能力是正常的。2020年发表的工作发现，在野生型和agl80突变体中用不同细胞特异性的marker去标记，发现助细胞的特异性marker在agl80突变体的中央细胞中也存在，但卵细胞的特异性标记在agl80突变体的中央细胞不表达¹³。相似的，agl80突变体中LUREs基因除了在助细胞中表达，在中央细胞等位置也有表达，这就解释了为何agl80突变体吸引花粉管的能力没有降低。

图十，agl80突变体中中央细胞表达辅助细胞的标记¹³

之后的工作发现AGL80包含一个c端EAR motif，该motif与协同抑制因子TPLs相互作用，在中心细胞中作为转录抑制因子发挥作用。AGL80通过直接结合MYB98基因上游启动子区域的CArG盒，抑制助细胞特异性基因MYB98的转录，这是助细胞细胞命运的主要决定因素。

图十一，MYB98:GFP和三个CArG盒发生突变的MYB98m:GFP的表达¹³

将上述工作总结来说就是CCG/CBP1/AGLs复合体非细胞自主性地在助细胞中调控LUREs的表达，并且指定中央细胞的命运。

此外，最近发表在Cell上的工作还发现，中央细胞分泌的这些小肽中，SALVAGER1(SAL1)和SAL2具有花粉管吸引能力，在助细胞吸引花粉管方面功能缺失的突变体myb98中，SAL1&2的表达大大增加，并且定向的分泌到胚珠的珠孔中，发挥吸引花粉管的功能。这说明当助细胞失活时，中央细胞参与调控双受精的补偿机制，保障植物种子的产生。

图十二，受精恢复过程中SALs的工作模型示意图¹⁴

总结来说，中央细胞在植物的生殖过程中起着核心作用。但中央细胞分泌的100多个小肽是否还有其他的功能？中央细胞与周围细胞信息交流的信使又是什么？这些问题还有待研究人员的进一步探索。

【参考文献】

1. Shi, D. Q. & Yang, W. C. Ovule development in Arabidopsis: progress and challenge. Curr. Opin. Plant Biol. 14, 74-80 (2011).

2. Yang, W. C., Shi, D. Q. & Chen, Y. H. Female Gametophyte Development in Flowering Plants. Annual Review of Plant Biology. 61, 89-108 (2010).

3. Li, H. J. & Yang, W. C. Central cell in flowering plants: specification, signaling, and evolution. Front. Plant Sci. 11, 12 (2020).

4. Sundaresan, V. et al. Patterns of gene action in plant development revealed by enhancer trap and gene trap transposable elements. Genes Dev. 9, 1797-1810 (1995).

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6. Ito, T. et al. The homeotic protein AGAMOUS controls microsporogenesis by regulation of SPOROCYTELESS. Nature 430, 356-360 (2004).

7. Chen, G. H., Sun, J. Y., Liu, M., Liu, J. & Yang, W. C. SPOROCYTELESS is a novel embryophyte-specific transcription repressor that interacts with TPL and TCP proteins in Arabidopsis. J. Genet. Genomics 41, 617-625 (2014).

8. Wei, B. Y. et al. The molecular mechanism of SPOROCYTELESS/NOZZLE in controlling Arabidopsis ovule development. Cell Res. 25, 121-134 (2015).

9. Yuan, L. & Sundaresan, V. Spore formation in plants: SPOROCYTELESS and more. Cell Res. 25, 7-8 (2015).

10. Shi, D. Q. et al. SLOW WALKER1, essential for gametogenesis in Arabidopsis, encodes a WD40 protein involved in 18S ribosomal RNA biogenesis. Plant Cell 17, 2340-2354 (2005).

11. Chen, Y. H. et al. The central cell plays a critical role in pollen tube guidance in Arabidopsis. Plant Cell 19, 3563-3577 (2007).

12. Li, H. J. et al. Arabidopsis CBP1 is a novel regulator of transcription initiation in central cell-mediated pollen tube guidance. Plant Cell 27, 2880-2893 (2015).

13. Zhang, M. X. et al. Transcriptional repression specifies the central cell for double fertilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117, 6231-6236 (2020).

14. Meng, J.G. et al. Central-cell-produced attractants control fertilization recovery. Cell 186, 3593-3605.e3512 (2023).