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2023年10月19日中午，受北大-清华生命科学联合中心、北京大学生命科学学院陈玥舟研究员邀请，西湖大学（Westlake University）孙仁教授在生命科学学院邓祐才报告厅带来一场题为“Develop high-throughput technologies to comprehensively define virus-host interactions: Rational design of vaccine”的精彩报告。

陈玥舟研究员介绍孙仁教授

孙仁教授做报告与交流

孙仁教授的工作整合了基因组学、蛋白质组学和结构生物学，在群体和单个病毒/细胞水平上描述生物学过程。他的团队开发出一种方法，能够以单核苷酸分辨率生成整个病毒基因组的功能图谱。这种方法为更全面地定义病毒与宿主的相互作用奠定了基础，并使病毒工程能够用于合理的疫苗设计。这种方法在流感病毒的体外和体内实验中都得到了验证：当免疫逃逸功能被系统地识别、并从病毒基因组中移除时，被改造的病毒免疫原性要高于野生型，且其毒性在体内大大减弱。因此，针对多种病原体，该方法都可成为生产治疗性或者预防性疫苗的普遍手段。此外，他的团队还开发高通量技术平台，以描绘表位特异性的抗体反应，并系统地定义感染或接种疫苗后宿主的免疫组。这些技术平台还将应用于过敏、自身免疫性疾病和神经免疫学的研究。

使用定量高通量基因组学鉴定 IFN 敏感突变

作者们用携带甲型/WSN/33（H1N1）流感病毒基因组的八质粒反向遗传系统用于构建突变质粒文库（1）。突变体被分为 52 个子文库，每个子文库在 240 个碱基对的小基因组区域中包含单核苷酸突变。通过将编码突变体子文库的质粒与编码野生型（WT）病毒蛋白的其他七个质粒共转染，在人胚肾293T细胞中重建病毒突变体文库。为了系统地鉴定 IFN 调节功能，在经过或未经外源 IFN 处理的 A549 细胞中选择所有病毒文库。测序用于识别每个突变体并计算每个子文库内相应的频率。突变病毒的相对适应度（RF）分数计算为所选病毒库中相对频率与质粒库中相对频率的比率。

图1. 突变文库构建与筛选策略

根据突变体在有无干扰素情况下的丰度，作者挑选出了部分对干扰素高敏感的突变体。为了最大限度地提高 IFN 敏感性和 IFN 诱导，他们结合了 PB2 上的三种 IFN 诱导突变（N9D、Q75H 和 T76A）、M1 上的三种突变（N36Y、R72Q 和 S225T）以及 NS1 上的两种先前报道的突变（R38A 和 K41A）创建 干扰素高敏感的HIS 病毒。

组合突变可增加体外干扰素敏感性和干扰素诱导

作者对组合突变产生的突变体病毒进行了测试（2），发现了其在干扰素敏感性和干扰素诱导上的巨大优势。HIS病毒的IFN敏感性显着高于NS1-R38A/K41A突变体。肺上皮细胞和巨噬细胞系（A549 和 THP1）的基因表达数据表明，HIS 病毒诱导更高的 IFN 产生和反应。使用 RNA 测序，作者进而评估了感染 WT、NS1-R38A/K41A 或 HIS 病毒的 A549 细胞中的整体基因表达变化。感染后6小时，HIS感染细胞中有120个基因的表达显着上调，其中24％是IFN反应基因。此外，HIS病毒诱导细胞凋亡过程的负调节因子，例如TNFAIP3，TNF介导的细胞凋亡的重要抑制剂。与 WT 感染相比，HIS 感染的细胞死亡速度较慢。

图2. 结合突变的HIS病毒有更好的干扰素敏感性与诱导性

HIS 病毒在具有 IFN 活性的动物中高度减毒

接下来，作者测量了 HIS 病毒在小鼠和雪貂（流感病毒最常用的动物模型）中的复制和发病机制。BALB/c小鼠鼻内接种不同剂量的WT或HIS病毒。到接种后第 2 天，HIS 病毒在小鼠肺组织中的复制显着低于 WT 病毒（减少约 3.6 个对数）或 NS1-R38A/K41A 突变体（减少约 2 个对数），并且与WSN-CA病毒。与在 WT 感染中观察到的强劲病毒复制（在 48 小时达到峰值）相反，在任何测试时间点，HIS 感染小鼠中均未检测到病毒拷贝数增加。此外，在IFNAR−/−小鼠中，HIS病毒的复制完全恢复至WT水平，表明无法抵消IFN反应是野生型小鼠中HIS病毒复制高度减毒的根本机制。在雪貂模型中，作者还观察到 HIS 病毒的显着减毒。感染后第 3 天，与 WT 病毒相比，HIS 病毒显示气管减少约 2 个对数，肺组织减少约 1.5 个对数。

图3. HIS 病毒在体内复制缺陷，会诱导短暂的 IFN 反应

HIS 病毒诱导强烈而广泛的适应性免疫反应

作者继而检查了 HIS 病毒诱导体液和细胞反应的能力。在单剂量接种 WT、HIS 或 WSN-CA 病毒后第 28 天收集小鼠血清和 BAL 样本。通过 ELISA和血凝素 (HA) 抑制和中和抗体测定测量，HIS 病毒诱导了强烈的抗体反应。HIS 病毒引起的 HA 抗体反应水平低于 WT 病毒，但显着高于 WSN-CA、灭活 WT 和灭活 HIS 病毒。除了体液反应外，HIS 病毒还引发 NP 和 PB1 抗原特异性 CD8 T 细胞反应，与 WT 病毒类似，甚至更多。

图4. HIS病毒病毒诱导了强烈适应性免疫反应

在传统的减毒病毒疫苗中，免疫原性通常不是最理想的。在这里，孙老师提出了一种用于疫苗开发的系统方法，该方法消除了全基因组范围内的干扰素（IFN）调节功能，同时保持病毒复制的适应性。对甲型流感病毒应用了定量高通量基因组学系统，同时测量整个基因组突变的复制适应性和干扰素敏感性。通过整合八个干扰素敏感突变，他们产生了一种超干扰素敏感（HIS）病毒作为候选疫苗。HIS 病毒在具有 IFN 活性的宿主中高度减毒，但能够诱导短暂的 IFN 反应，引发强大的体液和细胞免疫反应，并提供针对同源和异源病毒攻击的保护。他们的方法可以同时减弱病毒并促进免疫反应，广泛适用于针对其他病原体的疫苗开发。

[1] E. Hoffmann, G. Neumann, Y. Kawaoka, G. Hobom, R. G. Webster, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6108–6113 (2000).

[2]  Du, Y., Xin, L., Shi, Y., Zhang, T. H., Wu, N. C., Dai, L., Gong, D., Brar, G., Shu, S., Luo, J., Reiley, W., Tseng, Y. W., Bai, H., Wu, T. T., Wang, J., Shu, Y., & Sun, R. (2018). Genome-wide identification of interferon-sensitive mutations enables influenza vaccine design. Science (New York, N.Y.), 359(6373), 290–296. https://doi.org/10.1126/science.aan8806