◆ ◆ ◆ ◆

2023年12月14日下午，受北大-清华生命科学联合中心孔道春教授的邀请，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心李劲松研究员在生命科学学院邓祐才报告厅带来关于“类精子干细胞介导半克隆技术的建立与应用”的精彩报告。

李劲松教授讲座现场

通过核移植可以将精子重编程为孤雄单倍体胚胎干细胞系，这些细胞可以替代精子通过卵子注射高效产生半克隆小鼠（又称为类精子干细胞介导的半克隆技术）。该技术为构建复杂遗传改造小鼠模型提供新的工具，可以用于：（1）一步获得携带多基因突变的杂合小鼠模型，用于模拟人类多基因介导的复杂疾病；（2）快速获得携带人类疾病相关点突变小鼠，用于研究疾病发生的分析机制；（3）一步获得针对不同基因的突变小鼠，实现小鼠个体水平的遗传筛选；（4）一步获得针对编码特定基因的不同碱基突变的小鼠，实现蛋白质关键氨基酸的在体遗传筛选；（5）建立携带蛋白质标签的小鼠库，目前已获得2000余株标签细胞系，380余个小鼠品系，为全球90余个实验室提供了服务；（6）在类精子干细胞中靶向着丝粒切割产生了染色体头对头的融合，获得了一系列19对染色体的小鼠品系，模拟了自然界漫长过程形成的染色体融合事件。类精子干细胞介导半克隆技术为发育、疾病和演化研究提供了新手段。

一、类精子干细胞介导的半克隆技术的建立与优化

早在2012年，李劲松研究组建立了小鼠的孤雄单倍体胚胎干细胞，并证明这些细胞能够代替精子使卵母细胞“受精”产生半克隆小鼠1。其过程可简述为，向去核卵母细胞注射精子并培养成单倍体囊胚。取出囊胚细胞并体外培养获得孤雄单倍体胚胎干细胞（AG-haESCs）。随后，将AG-haESCs同步化至M期，通过胞浆内干细胞（显微）注射技术（ICAHCI）注射进卵母细胞发生受精，进而发育成为半克隆小鼠（图1）。

然而，制约该技术广泛应用的难题其一是胚胎发育率很低，仅2%，这导致产生的合格胚胎的数目稀少，不足以开展实验。其二是孤雄单倍体胚胎干细胞在培养过程中会快速二倍体化。要解决后一个难题，通常需要靠流式细胞术筛选出单倍体细胞，或通过过表达从头甲基化酶Dmnt3b以恢复孤雄单倍体胚胎干细胞全基因组甲基化水平和延缓其自发二倍体化2。

对于第一个问题，研究组通过CRISPR-Cas9遗传筛选，发现是孤雄单倍体胚胎干细胞的印记基因的表达出现问题。所谓“印记基因”，是指父本和母本基因组存在差异表达且不能相互替代的基因。印记基因差异表达通常受到亲本基因组上的差异甲基化区域（DMR）调控，如H19-DMR和IG-DMR。研究组结合以往所报道的文献，结合组内数据，发现孤雄单倍体胚胎干细胞和发育异常的半克隆胚胎均出现H19-DMR和IG-DMR甲基化丢失。于是，研究通过CRISPR-Cas9技术敲除了孤雄单倍体胚胎干细胞的H19-DMR和IG-DMR以模拟甲基化状态，获得DKO-AG-haESC细胞系，使半克隆胚胎发育率提升10倍至20%3。这就突破了之前的低效率瓶颈，使该技术的大规模应用成为可能。H19-DMR和IG-DMR双敲除的单倍体细胞也被称作“人造精子细胞”。

图1 孤雄胚胎干细胞（AG-haESC）系和半克隆小鼠模型的建立

二、小鼠发育中的靶向遗传筛选

孤雄胚胎干细胞的建立大大方便了致病基因筛查和蛋白质重要氨基酸残基的个体水平遗传筛选。这是可以通过结合半克隆技术和CRISPR/Cas9单碱基编辑技术（BE3）来实现。其作为在体应用的杰出案例之一，是实现了对小鼠原始生殖细胞（PGCs）发育的重要基因DND1的氨基酸功能位点的遗传筛选4。

Dnd1是在脊椎动物中保守的RNA结合蛋白，通过与NANOS2和CCR4-NOT复合物相互作用确保PGC存活；其突变将导致PGC缺陷和小鼠不育。Pfam分析表明Dnd1蛋白有三个功能结构域：RRM1、RRM2（RRM，RNA识别基序）和DSRM（DSRM，双链RNA结合基序）。由于以往研究并没有明确是哪些氨基酸残基介导Dnd1与后二者的蛋白质-蛋白质相互作用，研究组构建了两个靶向DND1基因的慢病毒sgRNA文库并转染至含高效BE3单碱基编辑系统的孤雄胚胎干细胞（向BE3的N末端和C末端添加NLS序列后所产生的4B2N1细胞系），产生4B2N1-DP1单倍体细胞群。随后，以4B2N1-DP1为供体，通过流式分选和胞浆内干细胞注射技术获得E12.5半克隆胚胎。经过筛选，分别获得DND1携带E59K、V60M、G82R、P67L-L77F纯合突变的胚胎。

为了确认筛选结果的可靠性，将BE3 mRNA和诱导相应点突变的sgRNA注射进受精卵，获得携带以上突变的纯合和杂合小鼠。研究组发现，携带E59K，V60M，P76L或G82R纯合突变的E12.5胚胎的性腺中PGCs完全缺失，但携带L77F突变胚胎的性腺发育正常。虽然携带造成胚胎性腺发育缺陷的四种突变的胚胎可以发育至成年个体，但睾丸和附睾内不存在生殖细胞。进一步观察携带E59K或P76L的E8.5和E9.5胚胎，发现其中PGC数目大大减少。

注意到以上有害突变均出现在RRM1结构域，且在不同物种中保守，故可以探索它们在蛋白质稳定性和蛋白质-蛋白质相互作用中所扮演的角色。通过同源建模、免疫沉淀和免疫印迹分析，发现这些突变均导致蛋白质稳定性下降，并主要破坏DND1和NANOS2相互作用。

综上所述，基于孤雄胚胎干细胞和单碱基编辑技术，可获得目标蛋白质携带某种（/些）氨基酸突变的胚胎和/或小鼠，从而精确分析或预测这种（/些）突变对胚胎发育和细胞生长的潜在影响。

图2 孤雄胚胎干细胞在体单碱基突变筛选流程及其在疾病相关突变预测的潜力

三、基于半克隆技术的基因组标签计划

人细胞中的蛋白质种类约两万多种。尽管人类基因组计划完成后人们乐观地认为所有的蛋白质的功能可以在较短时间内被研究清楚，但是时至今日仍有大量蛋白质未被人们完全认识，甚至完全不认识。

事实上，蛋白质的研究依赖抗体，但是现有抗体制备方案繁琐且成本高昂；同一蛋白质抗体种类繁多，需要根据实验选择不同的抗体；批次间抗体效价不稳定等因素都制约研究进度，导致时间和经费的极大浪费。因此，为蛋白质融合经典表位标签（如FLAG、HA、EGFP）将极大简化、标准化研究流程并节省科研时间和经费。基于这种设想，以及半克隆技术的单倍体优势，李劲松研究员提出“基因组标签计划”（GTP），即令所有在体蛋白质携带容易识别的标签，通过识别标签实现蛋白质的实时、动态研究的标准化。GTP的应用之一是蛋白质伙伴组（partnerome）的研究，即从基于一个或少数蛋白质的研究模式转变为群体蛋白质的伙伴组研究模式。

图3 基于半克隆技术的基因组标签计划简介（http://www.sibcb.ac.cn/gtp/index.jsp）

四、类精子干细胞介导的半克隆技术在染色体结构与功能研究中的应用

染色体数目的结构和稳定是物种生存和进化的基础，其数目或结构的异常都有可能引发疾病。基于系统生物学研究，人们发现距今三、四百万年前，人与黑猩猩的共同祖先内部产生了染色体结构上的分化。黑猩猩的12、13号染色体通过头对头融合（类似罗伯逊易位）形成现代人类的2号染色体。又如，很多已知的遗传疾病都与染色体结构或数目的异常密切相关。再如，人们在阿尔卑斯山脉的深山老林中发现一种只有19对染色体的小鼠种群，有别于常见的拥有20对染色体的小鼠。

作为单倍体，类精子干细胞非常适合用于探讨染色体性质与细胞命运之间的关系。李劲松研究组推测自发染色体易位中的重排断点可能发生在着丝粒区域。在类精子干细胞中使用靶向着丝粒序列的CRISPR-Cas9编辑技术，他们成功地建立了具有19条染色体的罗伯逊易位类精子干细胞系。进一步研究发现，小鼠2号染色体有两个着丝粒，同时染色体融合产生的罗伯逊易位细胞系与原始细胞系除了在染色体细胞核分区上存在差别外，转录组和3D基因组结构基本相似。在罗伯逊易位细胞系的基础上，通过半克隆技术和交配，研究组还建立了只有19对染色体甚至存在多重罗伯逊易位的小鼠。

以上结果表明，尽管具体DNA损伤修复机制尚不明确，着丝粒区域的断裂是造成染色体融合的关键原因，基因组的稳健性是染色体演化的重要基础5。从本工作也能看出，类精子干细胞是研究染色体结构和数目变化的利器。