2025年10月13日上午，受北大-清华生命科学联合中心PI李晴和北京大学定量生物学中心齐志教授邀请，哥伦比亚大学医学中心（Columbia University Medical Center）教授Rodney Rothstein在生命科学学院邓祐才报告厅带来一场题为“Seeing is believing:Mitotic recombination from 1936 to 2025”的精彩报告。

齐志教授介绍Rodney Rothstein教授

Rodney Rothstein教授做报告与交流

DNA双链断裂修复对于维持基因组的稳定性非常关键，同源重组修复是DSB（Double-Strand Break）修复中一个重要的方式。Rothstein教授在酵母体系中发现了同源重组，他致力于研究DNA双链断裂修复并开发新型基因组编辑工具。通过这些工具，他分离出维持基因组完整性的关键基因，并培育出用于活体成像研究的菌株，从而揭示细胞对DNA损伤的反应机制。在报告中，Rothstein教授介绍了有丝分裂中的crossover可能在后期细胞分裂中产生LOH(loss of heterozygosity），LOH在部分情况下会导致癌症等疾病的发生。Rothstein教授向我们讲述了细胞在面对DSB时的多种策略，比如形成Holliday juction的DSBR途径、可能产生LOH的SDSA途径和BIR途径。他们通过在酵母体系的五号染色体上利用I-Sccel酶切位点制造DSB后，借助lacO、tetO和parS序列可以特异性结合不同颜色荧光蛋白的特性，根据荧光蛋白的定位可视化展示了细胞选择DSB的修复方式，统计数据后发现有8%的细胞发生了LOH。Rothstein教授提到可以利用该系统尝试回答一系列的遗传学问题，比如，如果将一个基因重组相关的基因发生突变，染色体的不同修复行为的占比会怎么变化。通过实验发现，如果去除MRX复合物中的Xsr2蛋白，染色体丢失的比例会提升至57%。这些工作为DSB修复和基因组的稳定性提供了新的技术和研究方向，深刻影响了我们对细胞如何维持基因组稳定性的理解，这对于癌症研究和遗传性疾病至关重要。

有丝分裂时期同源染色体在空间上往往是分离的，只有在发生crossover时才会靠近彼此。同源染色体发生crossover后在子细胞中的分配行为可能会导致子代细胞发生LOH。如果杂合基因是隐性肿瘤抑制基因（如Rb），LOH的发生则可能会导致肿瘤的发生。在果蝇体细胞中，有时候会有紧邻的体表皮一部分是黄色体色普通刚毛，另一部分是棕色体色焦毛，我们称之为twin spot（孪生斑）。这样的表型发生，不仅让我们理解果蝇胚胎细胞在发育时是相互挨在一起的，同时也让我们观察到了crossover所导致的子代表型。在酵母体系中这样的表型更容易被观察到（图1）

图1，果蝇和酵母体系中的孪生斑

DNA双链断裂修复对于维持基因组的稳定性非常关键。细胞在面对DSB时可能会采用不同修复方式。图示（图二）蓝色染色体发生了DSB，红色染色体是其同源染色体也是断裂DNA的重组修复模板。在DSBR修复中，右侧蓝色DSB染色体片段的3’充当引物，在模板染色体上形成D-Loop（DNA Loop），产生的两个新蓝色染色体片段与模板染色体形成了Holliday junction进行crossover，从而使断裂的DNA完成修复。细胞还可以选择其他的方式，比如BIR，发生DSB的染色体会丢失一部分染色体（图示为左下角左侧染色体），右侧染色体以同源染色体为模板复制出整个左侧染色体，这种方式往往会导致LOH的发生；SDSA (Synthesis-Dependent Strand Annealing) 右侧蓝色染色体片段入侵模板染色体并进行了一部分链延伸后，在左侧蓝色染色体进入D-Loop之前解离，上侧的染色体利用这段延伸的链和下侧染色体进行互补配对，从而形成了不产生crossover的DSB修复。

图2：细胞面对DSB时采用的不同修复方式

为了探究细胞会选择哪一种DSB修复方式，Rothstein教授等人构建了DSB损伤修复可视化的酵母体系。酵母的一条五号染色体上有一个I-SceI酶切位点，并且这个位点在整个酵母基因组中只出现这一次，这个酶切位点会产生DSB。在这条染色体上还有lacO和tetO序列，这个菌株会表达特异性识别该序列的荧光蛋白（荧光颜色对应图示序列的颜色），另一条五号染色体会充当DSB修复的模板，且携带parS序列，酵母菌株也会表达特异性识别该序列的紫色荧光蛋白。通过三种荧光蛋白的可视化信号发现在细胞中这两个染色体在空间上是分离的。对上述提到五号染色体进行酶切，诱导DSB的产生，细胞可能进行以下几种选择：完全不修复，损伤的染色体丢失，红色和黄色荧光蛋白失去结合位点，胞内仅能观察到紫色；BIR，胞内仅能观察到分离的红色和紫色，这种情况往往伴随着LOH的发生；G1期的crossover，胞内观察到黄色和紫色定位接近，与红色定位分离；G2期的crossover，当子细胞为13，24的DNA组合时会发生LOH，组合为14，23的DNA组合时不发生LOH。根据实验结果显示，在一个菌落中有一半的细胞有两个分离的黄色信号，他们分别和紫色与红色共定位，另一半没有黄色信号，紫色和红色分离定位，这说明发生了G2 crossover，并且这两种细胞都发生了LOH。

图3：DSB损伤修复可视化的酵母体系

进一步统计no-LOH的菌落，借助计算机对数百甚至数千的细胞进行检测。统计发现超过一半的细胞维持和亲本细胞相同的染色体构造，只有8%的细胞发生了LOH。当DSB发生时，并不是所有断裂端都能入侵模板染色体形成D-Loop并修复的，事实是这种修复的成功率只有一半，结果中有57%的细胞没有形成crossover。有了这个系统之后，一系列遗传学问题都可以尝试回答：如果将一个与基因重组有关的基因突变会发生什么，染色体的不同修复行为的占比会怎么变化等等。Rodney教授利用xrs2突变株系对该问题进行了初步的回答，MRX（Mre11-Rad50-Xrs2）复合物可以结合到断裂DNA端促进DNA断裂端靠近在一起促进修复，Xrs2包含了核定位信号。实验结果发现xrs2突变株系中染色体丢失比例提升至57%。

为了探究细胞在哪个时期发生的DSB修复，Rodney教授就这一问题进行了讨论。如图所示（图4）黑色染色体上有酶识别的位点，一旦DSB发生并以红色染色体为模板修复后，黑色染色体就失去了酶切位点，不会再发生诱导的DSB了。如果DSB发生在G1，则整个菌落都是Ab aB，但在实际的实验中并没有见过Ab aB，实验室唯一见过的情况是Ab aB细胞紧邻着另一种ab AB细胞，也就是孪生斑的发生（这种情况是发生在G2期的crossover）。在图4左下角的情况中，Rothstein教授认为1号DNA难以找到4号DNA进行重组，类似G1 crossover。此外，在实验结果中也并没有看到过这种情况。断裂的染色体一般会倾向于找到最近的模板，当2号DNA和3号DNA进行 crossover之后，1号DNA再以2号DNA作为模板修复，这种情况可以检测到黄色和紫色共定位。所以Rothstein教授认为，即使是在G1时期发生的DSB，也只会在G2时期解决。

图4：DSB损伤修复发生的时期

Rothstein教授不是第一个提出这个想法的人，但是他可以真正将这个事情可视化。通过这场报告的学习让我们对DSB修复和基因组的稳定性有了更深的理解。