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2025年3月3日下午，受北大-清华生命科学联合中心郭强研究员邀请，东京大学（The University of Tokyo）的Radostin Danev 教授在生命科学学院吕志和楼带来一场题为“Addressing Experimental Challenges in Single Particle Analysis and cryo-Tomography”的精彩报告。

郭强研究员介绍Radostin Danev教授

Radostin Danev教授做报告与交流

冷冻电镜（Cryo-EM）在结构生物学领域取得了重大进展，尤其是在单颗粒分析（SPA）和冷冻电子断层扫描（Cryo-ET）等技术方面。SPA已被证明是一种强大且主流的工具，用于确定纯化生物大分子的三维结构，提供了蛋白质功能的结构基础。Cryo-ET能够提供细胞内部的纳米级别视图，并观察亚细胞结构在生理环境中的相互作用。

目前，Cryo-EM领域面临两大挑战，即冷冻电镜的普及和冷冻电镜性能的优化。这些挑战可以通过提升硬件、软件工具，改进数据采集策略来应对。基于此，Danev教授首先向我们介绍了新型冷冻电子显微镜CryoARM 200 HR，其具有在保持高分辨结构解析能力的同时较低的采购和维护成本，并通过实例展示了其在单颗粒分析中的优异性能。其次，针对Cryo-ET数据采集通量低的问题，Danev教授开发了平行冷冻电子断层成像技术（PACE-tomo），通过精确的样品运动预测，实现了单个细胞切片上多个区域的并行数据采集，显著提高了数据采集速度。最后，Danev教授介绍了最新的智能平行自动化冷冻电镜断层成像技术（SPACE-tomo），利用机器学习算法实现了从薄片检测到数据采集的全流程自动化，大幅减少了人工干预，提高了工作效率。这些技术的开发为冷冻电镜的普及和高性能应用提供了新的可能性，也为未来实现完全自动化的Cryo-ET奠定了基础。

高性能冷冻电镜的开发

Danev教授提到，Cryo-EM领域目前面临着两个方面的挑战。首先是如何实现冷冻电镜的普及。Danev教授指出，目前冷冻电子显微镜市场被垄断，随之而来的是高昂的价格与不合理的服务条款。因此需要冷冻电子显微镜市场出现更多的竞争来打破这一局面。其次则是如何全面提升冷冻电镜的性能，并提高信号收集的效率。

图1. 当前冷冻电镜领域面临的挑战与改进方法

Danev教授首先介绍了目前开发的新型冷冻电子显微镜CryoARM 200 HR，并展示了其在SPA领域的优异性能。CryoARM 200 HR相对于市面上其它电子显微镜体积更小，成本更低，价格大约是300KV高端电子显微镜的1/3。该电子显微镜的自动装载系统能够同时装载12个样品，并且光学操作色差分辨率更小。在光学性能方面，该电子显微镜能够达到与市面上高端电子显微镜大致相同的极限分辨率。CryoARM 200 HR还有两种可选配置，一种是静电剂量调制器（Electrostatic Dose Modulator，EDM），通过它可以连续调节电子束的强度，以在探测器上获得最佳曝光效果；另一种则是快速欠焦调制器1（Fast Defocus Modulator，FADE），即在物镜后焦平面添加独立光学元件，通过对物镜光阑进行静电偏置实现高速精确欠焦调制。随后，Danev教授介绍了一系列使用该新型电子显微镜进行结构解析的实例。例如，使用该新型电子显微镜检测单晶金样品时能够得到分辨率高达0.5Å的衍射斑点；Danev团队也成功使用该显微镜解析了G蛋白偶联受体（GPCR）的结构，并将分辨率从一开始的3 Å逐步提升到了1.96 Å。上述结果均显示了CryoARM 200 HR电子显微镜的优异性能。

图2. 新型冷冻电子显微镜CryoARM 200 HR的概况

PACE-tomo提高冷冻电镜断层成像的数据采集通量

在接下来的讲座中，Danev教授则着重介绍了Cryo-ET技术，以及团队对该技术的一系列改进与优化。Cryo-ET技术使用透射电子显微镜对冷冻样品从不同角度进行倾斜拍摄，获取一系列二维投影图像，再利用计算机算法对这些二维图像进行处理与三维重建，从而得到样品中的三维结构信息。电子断层成像技术有着单颗粒分析技术所不具备的优势，该技术能够提供细胞内部的纳米级别视图，并观察蛋白质在自然环境中的相互作用；但另一方面，断层成像技术的发展进度落后于单颗粒技术，目前还存在着一系列的问题与难点，例如收集数据的通量低，收集数据的时间是收集单颗粒图像的30倍2，数据处理流程也复杂且具挑战性。

图3. 冷冻电子断层扫描技术与单颗粒技术的比较

针对冷冻电子断层成像技术在高通量记录断层扫描倾斜系列方面存在局限，Danev教授对其进行了优化，开发了平行冷冻电子断层成像技术3（Parallel cryo electron tomography，PACE-tomo）。在传统的断层扫描技术中，对于每一个数据收集的区域，都需要在该区域旁边选择一个用于聚焦和追踪的区域，而PACE-tomo技术则基于样品几何模型和电子束位移，通过精确的样品运动预测，可以指定一个单一区域用于聚焦和追踪，然后将电子束移动到其他多个想要收集数据的区域，实现了在单个薄片上并行采集数十个倾斜系列，极大地提高了数据采集通量，使整体采集速度提升了约5倍。PACE-tomo技术也能够在不规则形状的细胞薄片（lamella）上收集信息。制样时，某些薄片可能由于过度加工而形状不规则，存在着较为狭窄区域。传统方法难以在这些狭窄区域放置追踪和聚焦区域，但使用PACE-Tomo技术则可以收集所有这些区域的数据。

图4. PACE-tomo基本原理

SPACE-tomo实现冷冻电子断层成像过程的全自动化

随后，Danev教授提到，技术的最终目的是实现完全自动化。而智能平行自动化冷冻电子断层成像技术（Smart parallel automated cryo-electron tomography，SPACE-tomo）是朝着这个方向迈出的第一步4。SPACE-tomo技术首先通过YOLO v8对低倍（Low-Magnification montage，LM）地图进行训练，识别和分类lamella，确定中倍放大（Medium-Magnification montage，MM）地图采集位置；接着用修改后的U-Net对MM地图进行二维分割，标记出细胞结构；然后依据不同的生物学需求，提供三种目标选择策略，包括最大覆盖、稀疏目标和边缘靶向；最后，通过Python脚本在SerialEM软件中执行操作，自动完成从样品加载到倾斜系列数据采集的过程，实现无需人工干预的自动化冷冻电镜断层扫描，有效提高数据采集效率和实验通量。SPACE-tomo技术实现了无人工干预的自动化工作流程，大幅减少操作员时间和显微镜空闲时间，提高了工作效率。也为后续实现完全自动化的Cryo-ET提供了坚实的基础。

图5. SPACE-tomo基本流程