接合是细菌间遗传物质交流的方式之一，在耐药性质粒的传递中发挥尤为重要的作用。在革兰阴性菌中，接合由IV型分泌系统 (type IV secretion system, T4SS) 介导，该系统能够产生性菌毛 (F菌毛)，将物质由供体细菌传递到受体细菌当中1。T4SS由外膜核心复合物 (outer membrane core complex, OMCC)、内膜复合物 (inner membrane complex, IMC)、连接OMCC和IMC的杆状结构 (Stalk) 以及环绕Stalk的环状复合物 (Arches) 共同组成2。此前研究并未获得T4SS的高分辨结构，对于其菌毛生成以及DNA传递的机制也不完全清楚。
报告中，Waksman教授向我们介绍了T4SS的高分辨率单颗粒冷冻电镜结构，T4SS由VirB1-VirB11以及VirD4共12种蛋白组成，其中VirB1为非必需组分3。在利用R388质粒表达得到的T4SS中，除VirB2、VirB11以及VirD4以外，其他的组分均能在发表的结构中被观察到(图一)。T4SS结构表现出了对称性上的不统一，不同亚复合物呈现出不同的对称性和聚合状态。IMC和Arches为六聚体，Stalk为五聚体，OMCC的I层为16聚体而O层则为14聚体。构成接合菌毛的结构蛋白和Stalk组分具有相同的起源且同为五聚体，研究人员通过结构分析和生化验证，阐述了Stalk具有识别受体细菌和招募菌毛结构蛋白、促进菌毛形成的结构基础。同时对结构的分析，也帮助研究者提出了一些假说来解释Stalk招募菌毛结构蛋白的功能受到抑制的结构基础。
高分辨的T4SS结构表明，不同亚复合物具有不同的对称性和聚合方式
报告首先展示了来自R388质粒的T4SS复合物的单颗粒冷冻电镜结构，整个T4SS由IMC、Arches、Stalk和OMCC四个亚复合物构成。其中OMCC的O层为VirB10 CTD、VirB9 CTD和VirB7构成，为14聚体；而I层由VirB10 NTD 和VirB9 NTD组成，尽管与O层由相同的蛋白组成，却是16聚体。Stalk由靠上的VirB5和靠下的VirB6组成，为五聚体，穿过Arches区域，连接OMCC和IMC。由VirB8头部区域构成的Arches为六个三聚体组成的六聚体环状结构，同样是六聚体的IMCC则包含了三个组分，分别是中心的VirB4二聚体和与其连接的VirB3和VirB8尾部。
VirB4是一种ATPase，其二聚体分为两种构象，分别是位于中心和外部，六个二聚体构成了环状的六聚体结构，与ATPase的六重对称性相符。同时，IMC包含另外两个组件，VirB3与中心的VirB4相互作用，而VirB8三聚体则与外部的VirB4接合，共同构成了完整的IMCC六聚体结构。
接合菌毛与Stalk区域具有相似的来源和聚合形式
整个结构中并没有连续的中央通道用于遗传物质运输，研究人员认为这种结构反映的是负责菌毛生成的T4SS的状态。菌毛是由VirB2蛋白构成的长螺旋管状聚合物，VirB2和VirB5、6是来源相似的蛋白，也都经历了相似的脱离磷脂层后的修饰过程。单层的菌毛由VirB2五聚体构成，与构成Stalk的五聚体VirB5和VirB6表现出一定关联。与David Becker的合作研究表明，VirB2和VirB5、6之间存在共同进化的关系，同时五聚体的VirB6结构可以很好地与菌毛基部相吻合，而VirB5则位于菌毛的顶部，可能发挥受体细菌表面受体的识别功能。
结合Patchdock、TrRosetta以及生化分析，作者初步提出了菌毛生成的可能机制：VirB2亚基结合VirB6亚基后，VirB2进入组装位点，而VirB6上空缺的结合位点可以进一步募集和结合VirB2并用于后续组装 (图4)。同时，ATPase VirB4结合在VirB6的下方，为整个过程提供能量，另一种ATPase VirB11也参与进来，在复合物组装过程中发挥着重要作用。
IMC上的VirB10残留揭示了一种抑制菌毛产生的可能机制
为了解释T4SS高分辨率单颗粒冷冻电镜结构中不存在菌毛结构的问题，研究人员对细菌发育进行了分析，发现只有在受体细菌存在的情况下才能产生菌毛结构，而体外表达和组装的T4SS无法完成菌毛的组装和维持。同时，Waksman教授希望进一步获得结构上的信息来解释无法产生菌毛的原因。随着更多结构数据的收集，研究者看到了更多结构上的细节，其中之一就是VirB10的发现。在更高分辨率的结构中，VirB10从IMC区域延伸到Arches区域，并与VirB6的跨膜区域相结合。这些VirB10从上端进入跨膜区域，通过与VirB6招募VirB2的区域相结合，阻碍了Stalk区域介导的菌毛合成过程。尽管可以认为当接触受体细胞后可以中止VirB10的抑制作用，其产生和调节机制仍然不够清楚。
报告中介绍的高分辨率T4SS结构并不包括可以通过遗传物质的通道结构，也不包含菌毛结构，因此被认为是革兰阴性菌细胞膜上负责菌毛生成状态下的复合物结构。尽管缺乏一些关键的结构信息，研究人员仍然通过复杂的实验完成了整个复合物的表达和构建，获得了T4SS的高分辨率结构，因此得以对整个复杂结构中的各种细节进行分别分析，发现了很多之前的研究没有发现的结构细节，提出了T4SS发挥其生理学功能的合理假设，并设计生化实验进行了详实的验证。对于结构中可以看到的OMCC、Stalk、Arches和IMC等区域，Waksman教授对这些复杂结构的特点进行了生动的描述，而对于无法看到的菌毛及其他关键亚基，教授及其团队也通过结构分析，提出了合理的假设，并利用新的研究工具和方法进行了更有效的分析。
报告结束后，在场的老师和同学们也表现出了浓厚的兴趣，针对复合物的构建，菌毛的产生机制和DNA运输的问题提出了自己的见解和问题，Waksman教授针对这些问题进行了细致的解答，整场报告的热烈的讨论氛围中迎来了尾声。
