2024年04月11日下午，受生命中心孔道春教授邀请，上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心的周斌兵教授在北京大学生命科学学院邓祐才报告厅带来一场题为“DNA Damage Responses Drive Childhood ALL Relapse Clonal Evolution”的精彩报告。
儿童急性淋巴白血病（Acute lymphoblastic leukemia, ALL）是发生在儿童中最常见的一种癌症类型。目前治疗儿童ALL的主要手段是使用巯嘌呤进行化疗，其中最广泛使用的是6-巯鸟嘌呤（6-thioguanine, 6-TG），它通过代谢成6-巯-2-脱氧鸟嘌呤（6-TdG）后进入基因组来发挥毒性效应。尽管目前儿童ALL的治愈率超过80%，但是仍然有超过10%的患者会在传统的化疗过程中耐药复发。目前针对儿童ALL复发的预后和治疗方案仍不完善，这是导致ALL治疗失败的重要原因（Hiroto Inaba et al., 2020）。
TP53是癌症中最常见的一个突变基因（Ludmil B. Alexandrov et al., 2013）。在儿童ALL中，确诊时很少出现TP53的突变，但是在复发时却显著富集TP53突变。这些复发特异性的TP53突变可能在ALL诊断时以亚克隆的形式存在，也可能是在治疗过程中由巯嘌呤等化疗药物诱导产生。此外，在复发ALL中，存在一种巯嘌呤印记（也叫印记B），基因组存在显著的C>T突变倾向，以及弱的C>G突变倾向（Nikki A. Evensen et al., 2021）。
周斌兵研究组通过对复发ALL全基因组测序，发现一种与巯嘌呤印记相似的特征，基因组存在显著的C>T突变倾向，但不存在C>G突变倾向，并且这一现象在错配修复（Mismatch repair，MMR）缺陷的患者中尤为显著。因此，研究组将这一特征命名为Thio-dMMR印记。Thio-dMMR印记存在链偏好性，主要在转录链上出现。同时，研究组发现在复发ALL的患者中，TP53突变主要为R248Q突变。并且，Thio-dMMR印记与TP53 R248Q突变之间存在显著关联。这提示在巯嘌呤治疗的ALL患者中，Thio-dMMR印记可能直接诱导TP53 R248Q的产生，进而引发肿瘤细胞的耐药，导致癌症复发（Fan Yang et al., 2021）。在这一基础上，周斌兵研究组进一步研究发现，在MMR缺陷的复发ALL患者中，碱基切除修复（Base excision repair，BER）途径的DNA聚合酶β（POLB）在肿瘤细胞耐药过程中发挥重要作用，通过敲除或抑制POLB可增加耐药细胞对巯嘌呤的敏感性（Ji-Yuan Teng et al., 2023）。这些工作为对抗侵袭性ALL提供了治疗靶点。
Thio-dMMR印记与MMR缺陷显著关联
为鉴定复发ALL的特征，研究组对181个复发ALL的样本进行全基因组测序分析，并对其单核苷酸突变（single-nucleotide variant，SNV）的COSMIC突变特征进行分类统计，其中包括特征87（巯嘌呤印记）、特征86（未知成因的复发ALL特异印记）、以及thio-dMMR（巯嘌呤治疗诱发的MMR缺陷依赖特征）。其中，153个患者具有已知可靠的特征，并且大多数已知的特征具有比较低的突变率。在这153个患者中，25个（16.3%）具有巯嘌呤印记，14个（9.2%）具有Thio-dMMR印记。Thio-dMMR印记具有最高的突变率，几乎是巯嘌呤印记突变率的10倍。在Thio-dMMR印记组中，患者均存在MMR相关基因的缺陷突变，包括MSH2、MSH6、PMS2和MLH1。（图一）
图一，复发ALL样本中的突变特征
Thio-dMMR印记具有C>T突变倾向
研究组对患者的全基因组测序数据进行了分析，其中591个确诊ALL患者，在CCG位置存在C>T突变，占体细胞SNVs的4.4%，该现象与COSMIC特征1（一种与5-甲基胞嘧啶脱氨有关的普遍特征）相似。在10个复发ALL患者中，≥50%的突变来自已报道的巯嘌呤印记（COSMIC特征87），在CCG位置，复发特异突变中C>T的突变率为15.7%，远高于在确诊ALL患者中的比例（图二A）。在MMR缺陷的ALL患者中，14个具有与标准MMR缺陷特征不同的特征。在NCG位置上，他们具有C>T突变倾向，但不具有C>G突变倾向（图二B）。并且，在CCG位置上的C>T突变，包括了TP53 R248Q突变。在MMR正常的细胞中，药物治疗后倾向出现C>T和C>G两种突变倾向，但是在MMR缺陷的细胞中，药物治疗后主要出现C>T突变（图二C）。
图二，ALL患者中的Thio-dMMR突变特征
同时，研究组也在细胞系中对Thio-dMMR印记进行了验证。在MCF 10A野生型的细胞中，6-TG处理后，出现C>T和C>G两种突变倾向；但是在MCF 10A MSH2-/-的细胞中，6-TG处理后，出现C>T突变倾向，但是却没有C>G突变倾向（图三）。
图三，在细胞系中验证Thio-dMMR的突变特征
Thio-dMMR印记偏好出现于转录链
为确定thio-dMMR印记是否具有链偏好性，研究组对转录链和非转录链的thio-dMMR印记进行了统计。结果发现thio-dMMR印记中，在NCG区域，C>T突变在转录链上的比例显著高于非转录链，说明thio-dMMR印记具有显著的链偏好性，在NCG区域，C>T突变倾向出现在转录链上。这与巯鸟嘌呤在转录链上会抑制RNA聚合酶以及激活转录偶联的核苷酸切除修复有关，当巯鸟嘌呤存在于转录链上时会被修复，与标准的巯嘌呤印记形成过程相似（图四）。
此外，在6-TG处理后的Nalm6细胞中，CpG甲基化集中出现在thio-dMMR印记的C>T突变中，这一结果表明DNA甲基化可能在调控复发特异性突变过程中发挥作用。
图四，Thio-dMMR印记的转录链偏好性
巯嘌呤可诱导产生TP53 R248Q突变
为了探究巯嘌呤是否可以直接诱导MMR缺陷细胞产生TP53 R248Q突变，研究组分别用6-TG处理了MCF 10A野生型的细胞、MSH2-/-细胞和Nalm6细胞，并通过ddPCR统计处理前后产生的thio-dMMR印记相关的TP53 R248Q、R175H、R158H和R267Q突变，同时以与thio-dMMR印记无关的TP53 R248W、R158C突变作为负对照。如图所示，6-TG处理的MSH2-/-细胞和Nalm6细胞，随着处理时间的增加，在R248Q位点逐渐产生明显的C>T突变率升高，同时也在R175H、R158H和R267Q位点产生稍微弱一点的C>T突变率增加趋势。在作为负对照的R248W、R158C突变中，6-TG的用药没有带来C>T突变率变化。在MCF 10A野生型的细胞中，随着6-TG的用药时间，在TP53 R248Q、R175H、R158H、R267Q、R248W和R158C突变位点均没有产生明显的C>T突变率变化。这表明，在MMR缺陷的细胞中，巯嘌呤可以不同程度地诱导产生C>T突变引发的TP53 R248Q、R175H、R158H和R267Q突变，其中影响最明显的是TP53 R248Q突变（图五）。
此外，在复发ALL中TP53 R248Q的突变程度显著高于确诊时的ALL。这一结果表明在MMR缺陷的患者中，巯嘌呤可能诱导产生TP53 R248Q突变，使肿瘤细胞获得耐药性，进而导致癌症复发。
图五，巯嘌呤诱导MMR缺陷细胞产生thio-dMMR印记突变
抑制POLB与MMR缺陷合成致死
MMR缺陷与复发ALL中巯嘌呤耐药性相关的突变产生密切相关。研究组随后更深入地探究了在缺乏MMR的情况下，巯嘌呤如何诱导进行DNA损伤修复。BER通常被认为在修复包括氧化、脱氨基化和烷基化在内的各种形式的碱基损伤中发挥重要作用，并且可能也参与碱基类似物的修复。作为BER途径中的关键聚合酶，DNA聚合酶β（POLB）负责通过在单链断裂处插入正确的核苷酸来补齐间隙。除了其聚合酶活性外，POLB在修复过程中还具有去氧核糖磷酸裂解酶活性，这两者对其在DNA损伤修复中的作用至关重要。
为探究POLB是否在MMR缺陷的ALL细胞中帮助细胞产生巯嘌呤耐药性，研究组在MMR缺陷的细胞中抑制POLB，检测细胞的基因组稳定性。OA是POLB的抑制剂，可以抑制其DNA聚合酶活性和去氧核糖磷酸裂解酶活性。与对照组的细胞相比，697 sgMSH2细胞的存活率在更低的OA浓度下便出现明显下降。这表明，MSH2敲降的细胞对OA的敏感性更高（图六A）。在697 sgMSH2细胞中，OA处理会产生更多的AP位点，并且在联用6-TG和OA时，细胞内的AP位点进一步增加（图六B）。通过DNA彗尾实验，检测到6-TG处理后，MSH2缺陷的细胞相对于MSH2完整的细胞产生了更短的彗尾，这与6-TG耐药表型一致。但是在OA和6-TG联用时，MSH2缺陷的细胞产生了相对于单独使用OA或6-TG更长的彗尾，表明联用处理后的细胞中产生了更多的DNA单链或双链断裂（图六C）。这表明，在MMR缺陷的ALL细胞中，抑制POLB会使得基因组更不稳定，MMR缺陷和POLB抑制产生合成致死效应。
图六，联用OA和6-TG可更好杀伤MMR缺陷ALL细胞
POLB抑制剂和巯嘌呤联合用药可提升抑癌效果
为探究抑制OA和6-TG联用杀死MMR缺陷的ALL细胞这一方法，是否可以有效地应用到体内用于治疗ALL，研究组在异种移植小鼠模型中，验证了OA或OA联合巯嘌呤作用于MMR缺陷细胞时的杀伤效果。在长时间的生存实验中观测到，在MSH2缺陷的小鼠中，相对于单独使用OA，联合使用OA和巯嘌呤可使小鼠的生存时间更长（图七）。因此，体内实验表明，由OA介导的POLB抑制作用，具有抑制MMR缺陷的ALL细胞生长的潜能。
图七，联用OA和6-TG提升ALL小鼠生存率
周斌兵教授研究组的工作提示在ALL治疗过程中，DNA损伤修复可能诱发耐药基因突变，进而导致癌症复发。这一研究为儿童ALL预后复发和治疗提供了新的联合化疗思路，也为克服化疗药物耐药突变提供了新的方向。
