2024年3月28日下午，受北大-清华生命科学联合中心钱永军研究员邀请，斯坦福大学化工系助理教授高小井博士在北京大学生命科学学院金光101报告厅带来一场题为“Towards DNA-freesynthetic biology: proteincircuits and RNA sensors”的精彩报告。
在合成生物学领域，一种理想生物分子电路可感知细胞状态、处理信息并能传递出相应的治疗结果，但绝大多数技术都局限在DNA领域。但由于表观遗传修饰的存在，DNA回路的运作可能变得不可控。合成蛋白线路则具有更多的优势，比如更加快速的调控过程、与内源信号通路更加直接的偶联、可以直接将蛋白酶RNA转录本递送进目的细胞，无需将基因整合进目的细胞基因组之中等。高小井博士此前设计了CHOMP（circuits of hacked orthogonal modular proteases）系统，其中作为输入信号的蛋白酶可以与靶蛋白酶实现结构上的对接并切割靶蛋白酶，从而以抑制靶蛋白酶的功能。但这些蛋白质电路都是在胞内运行的，由于在细胞间“感知“和”响应“方面还存在不足，所以无法通过此类系统实现细胞和免疫系统进行“对话”，来调控细胞之间的信号。由此高小井博士团队，设计了一个受到蛋白酶调控的细胞间信号分泌和展示的系统RELEASE（Retained Endoplasmic Cleavable Secretion），包含4种组分：一个面向ER的连接子、含有一个furin内蛋白酶切割位点、一个跨膜锚定结构域、一种含有蛋白酶裂解位点和细胞质ER保留基序的胞质连接物。这一系统不仅可以调控这个细胞自身的生死或者其他功能，也可以调控这个细胞和它周围细胞相互之间的通信。但蛋白回路工程化较难，探测不同的蛋白信号要付出较高成本。与此相对，探测一个特定的RNA则会容易的很多，因为RNA和RNA之间能够形成特异的互补双链。基于此他们团队又开发了RADAR平台，RADAR传感器由三部分组成：标记编码序列、与靶标RNA反向互补的传感器序列以及输出编码序列。这项技术利用ADAR介导的RNA编辑将细胞特异性RNA的检测与效应蛋白的翻译结合起来，具有区分与疾病相关的突变，在生物体中发挥作用的潜力。综上，本次报告中高小井博士主要分享了他在蛋白质电路和 RNA 传感器方面的工作。
模块化平台RELEASE通过控制蛋白质分泌调控胞间信号
Retained Endoplasmic Cleavable Secretion （RELEASE）平台包含4种组分：一个面向ER的连接子、含有一个furin内蛋白酶切割位点、一个跨膜锚定结构域、一种含有蛋白酶裂解位点和细胞质ER保留基序的胞质连接物。目标蛋白融合到RELEASE中，并通过二赖氨酸ER保留结构域（紫色菱形）保留在内质网中。在蛋白酶（如TEVP（橙色部分环））激活或表达时，ER保留域被移除（中间图），目标蛋白通过组成型分泌途径转运。当到达反式高尔基体（右图）时，天然furin蛋白酶内切连接子区域，从而分泌膜结合蛋白。
图二，RELEASE设计[1]
RELEASE可支持涉及电路多输入调节的逻辑运算
将两个蛋白酶切割位点串联插入细胞质连接体即可实现“OR”门。而“AND门的实现依赖于在目标蛋白的N和C末端分别插入p450信号锚定序列和二赖氨酸基序，两者必须都切除才可令蛋白释放。同样地，RELEASE还可以同其他蛋白电路进行耦合。具体是将蛋白酶（A）分为互补的两半，并将两者分别同失活结构域结合从而抑制其切割活性。切割位点（B）被设计在抑制蛋白非活性结构间，只有当蛋白酶（B）切割该位点暴露A的两个活性片段并自发互补后才可进一步切割序列(A)，释放响应蛋白。
改造RELEASE以响应突变RAS蛋白
在该系统的生物应用方面，研究者设计了一种响应突变RAS蛋白的电路，将TEVP 的 N 端和 C 端融合到 Raf 的 RAS 结合域 （RBD） 上。当RBD与活化的KRAS结合时,就会诱导两个TEV半片段重新组装并重建蛋白酶活性。重组的TEVP通过切除一个"笼子"结构来活化中间的TVMVP。TVMVP 包含一个 CC 结构域，该结构域驱动其与半锚定在 ER 膜上的另一个分裂 TVMVP 上存在的互补 CC 结构域结合。最后，重组的TVMVP 切割 RELEASE 的 ER 驻留基序以分泌 SEAP，从而溶解RAS突变细胞，同时对细胞因子分泌进行编程，以激活更广泛的局部免疫反应。
图三 利用RAS感应环路和蛋白酶释放途径来激活RELEASE[1]
RADAR传感器设计
随着单细胞转录组的可用性不断提高，RNA特征为靶向活细胞提供了有希望的基础。且因为RNA和RNA之间能够形成特异的互补双链，与蛋白质相比，探测一个特定的RNA则会容易的很多，分子RNA传感器将能够在不同情况下对特定细胞类型/状态进行研究和治疗干预。基于此高小井教授团队设计了一种模块化的可编程系统RADAR（ live RNA sensing using adenosine deaminases acting on RNA），使用作用于RNA的腺苷脱氨酶（ADAR）进行活体RNA传感。
RADAR传感器由三部分组成：标记编码序列；与靶标RNA反向互补的传感器序列，但在中央 UAG 终止密码子处具有编辑增强 C：A 错配；以及输出编码序列。一旦靶标RNA与传感器序列结合，形成dsRNA，RADAR触发ADAR对上游终止密码子的编辑，将UAG中的腺苷（A）编辑为肌苷（I），表达输出蛋白。而无靶标RNA存在时，终止密码子阻止输出编码序列的翻译，因此只表达上游的标记蛋白。（图四）
图四，RADAR设计[2]
RADAR传感器验证
高小井博士团队在人胚胎肾 （HEK） 293 细胞中测试和优化了 RADAR。首先，证明了传感器S1的输出取决于相应靶标RNA T1的表达。并且，RADAR的运行对ADAR具有依赖性，而在其中ADAR1的p150亚型对输出的增强输最显著（图五b）。接着，他们发现S1的输出信号与输入的T1数量具有一定的线性关系，这为RADAR的定量检测潜力提供了一定的支持（图五c）。之后，他们应用Cre-Loxp系统进行输出，证明了RADAR系统的输出是模块化的（图五d）。后续，他们还引入了多西环素诱导系统放大输出信号（图五e）。并且，他们针对小鼠Bdnf的3’UTR内的一段子序列设计传感器，证明了该设计能在天然的3’UTR的复杂环境中发挥作用。（图五f）。他们还评估了RADAR在HEK293细胞中检测内源性RNA的能力，、使用小干扰RNA（siRNA）将GAPDH表达降低到不同的水平，结果显示GAPDH水平降低到野生型水平的24%和34%之间后，产生的输出信号是无法区分的，而在野生型的59%和更高水平时，输出显著升高，这表明RADAR输入的灵敏度在34%和59%之间（图五g）。此外，他们还研究了针对热休克反应蛋白DNAJB1的3’UTR的传感器，结果显示，传感器类型、热休克和针对DNAJB1的siRNA之间存在显著的相互作用，这表明DNAJB1传感器对热休克诱导和siRNA敲低 DNAJB1表达的信号敏感。（图五h）。
图五，RADAR系统的验证[2]
最后,高小井博士团队评估了RADAR在缺乏内源性ADAR的植物中的性能。他们在植物中外源导入RADAR传感器、ADAR蛋白以及触发器RNA,除了将启动子和载体切换为植物专用外,未进行其他优化。结果显示,与本氏烟草中不能互补配对的触发器相比,可以与RADAR传感器互补配对的T1触发器的荧光输出增加(图3e)。这表明RADAR的核心机制在异源环境中仍能发挥作用,因此可能在广泛的物种中具有应用价值,甚至可用于那些缺乏内源ADAR的生物体系。
图六，RADAR系统在缺乏内源性ADAR的植物中的评估[2]
