生命中心李丕龙课题组开发基于相变的互作筛选新技术并揭示新型冠状病毒高阶蛋白复合物的组成
病毒如何高效复制？复制复合物如何形成？宿主的免疫反应如何逃逸？诸如此类的一系列病毒生活史事件均离不开病毒-病毒及病毒-宿主蛋白间的相互作用。2020年4月30日，加州大学旧金山分校定量生物科学研究所（QBI）的研究人员在《Nature》在线发表题为：A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing的研究论文[1]。虽然该项研究绘制了病毒与人类蛋白的互作图谱，并揭示药物潜在靶点，但由于SARS-CoV-2拥有十分复杂的复制及组装机制，了解其机制必须首先了解其编码蛋白是如何协同发挥作用。面对新冠肺炎在全球的肆虐，时间就是生命，因此如何快速、高效且准确地揭示SARS-CoV-2病毒编码蛋白间的相互作用关系，并筛选到靶向干预互作的小分子药物便成为了重中之重。
虽然已有较多技术用来检测蛋白与蛋白之间的相互作用，其中只有少数适合于大规模和高通量的蛋白相互作用分析，且与靶向互作的小分子调控物筛选各自独立，均费时费力。为了弥补现有互作筛选及鉴定技术的不足，受生物大分子间液-液相分离（Liquid-Liquid Phase Separation，LLPS，简称“相分离”）现象的启发，李丕龙课题组前期曾创造性地利用对生物大分子的高度富集效应，以及相变液滴易于观察的特性，在体外建立了生物大分子的互作检测及高通量筛选互作调控物（phase-separated condensate-aided enrichment of biomolecular interactions in test tubes, CEBIT）的技术体系[2]。
2021年7月17日，清华大学生命学院李丕龙课题组在《细胞报告》（Cell Reports）在线发表题为“Compartmentalization-Aided Interaction Screening Reveals Extensive High-Order Complexes within the SARS-CoV-2 Proteome”的研究论文[3]，该研究利用基于相变的蛋白互作新技术，从细胞层面系统性地分析SARS-CoV-2病毒蛋白间的互作网络，并创造性地挖掘出多个潜在的高阶复合物，为干预新冠疾病提供了更为高效快捷的新靶点及新策略。
考虑到部分蛋白的表达及纯化较为困难及无法还原细胞内的真实互作情况，研究人员在前期CEBIT体系的基础上设计了一套基于相变且适用于从细胞层面鉴定蛋白互作及高通量筛选互作调控物的新技术，并命名为CoPIC （Compartmentalization of Protein-protein Interactions in Cells），其设计原理如下：（i）首先通过相分离建立能够在细胞中形成无膜区室的体系骨架；（ii）待研究的蛋白互作对中的其中一个组分蛋白与相分离骨架连接在一起，确保该组分能在无膜区室中富集；（iii）通过检测蛋白互作对中的其它组分是否招募到无膜区室中，即可判断互作（图1-A）。接下来，研究人员以经典互作组合MDM2-p53及Polycomb Repressing Complex 2（PRC2）的蛋白组分为例，通过简单的二元及多元表达组合验证了该技术可用于快速、高效且精准地鉴定蛋白间的直接/间接相互作用。
图1 利用基于相变的互作招募体系评估直接和间接相互作用
独立于病毒粒子的组装，SARS-CoV-2的复制是由Nsps的多亚基复制/转录复合物（RTC）以及核衣壳蛋白N共同参与介导的。研究人员在易感细胞Vero E6中克隆、标记和表达了14个与复制密切相关的病毒编码蛋白，通过一对一的双向CoPIC筛选共发现47对相互作用，其中16对组合同时存在于SARS-CoV与SARS-CoV-2中，而31对组合为该研究首次鉴定发现。此外，借助于清华大学医学院丁强团队的SARS-CoV-2反式互补系统，以N蛋白为例的病毒蛋白互作也在模拟的病毒生命周期中得到了验证。在二元结果的基础上，后续的间接互作筛选更是出乎意料地鉴定到了31对三元复合物，其中不少组合的三维结构解析更是佐证了其存在[4-6]。
图2 SARS-CoV-2复制相关蛋白间的二/三元互作筛选
综上所述，该研究通过开发一种基于相变的蛋白互作及高通量筛选体系，巧妙地将二者联系在一起，实现了“一体系多用途”，并凭借着其简单易操作、特异且高效的优势，以SARS-CoV-2冠状病毒为模型，系统性地研究了病毒编码蛋白间的二元和多元相互作用关系，为加深对病毒致病机理的认识及后续新冠肺炎的防治提供了新的思路和切入点。
图3 靶向特定互作对的小分子药物筛选模式图
据悉，生命中心李丕龙研究员为本文通讯作者；生命中心博士后许伟凡、博士生裴高峰和清华大学本科生（现为约翰霍普金斯大学博士生）刘泓睿为本文的共同第一作者。清华-北大生命科学联合中心（CLS）、国家自然科学基金委等为本研究提供了经费支持。
原文链接：
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(21)00909-8
参考文献：
1. Gordon, D.E., et al., A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature, 2020. 583(7816): p. 459-468.
2. Zhou, M., et al., Phase-separated condensate-aided enrichment of biomolecular interactions for high-throughput drug screening in test tubes. The Journal of biological chemistry, 2020. 295: p. 11420-11434.
3. Xu, W., et al., Compartmentalization-Aided Interaction Screening Reveals Extensive High-Order Complexes within the SARS-CoV-2 Proteome. Cell Reports, 2021: p. 109482.
4. Yan, L., et al., Architecture of a SARS-CoV-2 mini replication and transcription complex. Nature communications, 2020. 11(1): p. 1-6.
5. Yan, L., et al., Cryo-EM structure of an extended SARS-CoV-2 replication and transcription complex reveals an intermediate state in cap synthesis. Cell, 2020.
6. Wang, Q., et al., Structural Basis for RNA Replication by the SARS-CoV-2 Polymerase. Cell, 2020. 182(2): p. 417-428.e13.
